पादप कोशिकाओं (plant cells) के सफल संवर्धन (culture) में ऊतक संवर्धन (tissue culture) के लिए माध्यम (medium) का संगठन सबसे महत्वपूर्ण प्रमुख कारक है। माध्यम में अकार्बनिक (inorganic) और कार्बनिक (organic) रासायनिक योजक (chemical additives) सटीक रूप से परिभाषित होने चाहिए ताकि यह प्रदान कर सके: i) संवर्धन के तहत पादप कोशिकाओं, ऊतकों (tissues) और अंगों (organs) के जीवित रहने के लिए पोषक तत्व, और ii) pH, परासरण दाब (osmotic pressure) आदि की इष्टतम (optimal) भौतिक स्थिति।
पादप कोशिकाओं के संवर्धन में, इन विट्रो (in vitro) संवर्धन के अनुकूल इष्टतम प्रकार के माध्यम का निर्माण कई साल पहले हासिल कर लिया गया था। Knop's (1865) खनिज विलयन (mineral solution) प्रारंभिक शोधकर्ताओं द्वारा व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला माध्यम था। Gautherat (1939) ने Uspenski और Uspenskaia (1925) पोषक विलयन से कैलस संवर्धन माध्यम (callus culture medium) विकसित किया। संवर्धन में पादप ऊतक और अंगों की खनिज आवश्यकताओं का व्यवस्थित अध्ययन Murashige और Skoog (1962) द्वारा किया गया, जिसके बाद वैज्ञानिकों Linsmaier और Skoog (1965), Vasil और Hildebrant (1966) और Nitsch और Nitsch (1969) ने विशेष जरूरतों के अनुरूप कई माध्यम विकसित किए।
एक मानक आधारीय माध्यम (standard basal medium) में मैक्रोन्यूट्रिएंट्स (macronutrients) और माइक्रोन्यूट्रिएंट्स (micronutrients) (आमतौर पर Ca, Mg, K, Na, Fe, Zn और B के क्लोराइड, नाइट्रेट, सल्फेट, फॉस्फेट और आयोडाइड के लवण), एक कार्बन स्रोत (carbon source), विटामिन, फाइटोहार्मोन (phytohormones) और कार्बनिक योजक (organic additives) का संतुलित मिश्रण होता है। उपर्युक्त पोषक तत्वों में से कुछ आवश्यक (essential) हैं और कुछ वैकल्पिक (optional) हैं। आवश्यक घटकों में अकार्बनिक पोषक तत्व और कार्बोहाइड्रेट जैसे कार्बनिक पोषक तत्व शामिल हैं, इसके अलावा फाइटोहार्मोन और विटामिन; प्राकृतिक अर्क (natural extract) और तरल भ्रूणपोष (liquid endosperm) जैसे कार्बनिक योजक वैकल्पिक हैं।
प्लांट सेल कल्चर के अकार्बनिक पोषक तत्व वे होते हैं जिनकी सामान्य पौधों को आवश्यकता होती है। अधिकतम वृद्धि दर (growth rates) प्राप्त करने के लिए प्रत्येक पोषक तत्व की इष्टतम सांद्रता (optimum concentration) काफी भिन्न होती है। प्रमुख तत्व N, P, K, S, Mg और Ca हैं। अन्य पोषक तत्व जैसे Co, Fe, B, Zn, Mo, Cu, I सूक्ष्म तत्व (microelements) हैं।
नाइट्रोजन (Nitrogen)
सभी खनिज पोषक तत्वों में N संवर्धित ऊतकों की वृद्धि और विभेदन (differentiation) में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। अकार्बनिक नाइट्रोजन की सीमा आवश्यकताओं के अनुसार 25 mM से 60 mM तक होती है। नाइट्रोजन आमतौर पर \(NO_3\) के साथ \(NH_4\) के रूप में आपूर्ति की जाती है। नाइट्रोजन स्रोत के रूप में अमोनियम आयन (Ammonium ion) आमतौर पर अनुपयुक्त है, शायद इसलिए क्योंकि ऐसी स्थितियों के तहत संवर्धन के दौरान माध्यम का pH 5 से नीचे गिरने की प्रवृत्ति रखता है, जिसके परिणामस्वरूप नाइट्रोजन की उपलब्धता कम हो जाती है। जब माध्यम को मैलेट (malate), सक्सिनेट (succinate), साइट्रेट (citrate) या फ्यूमरेट (fumerate) जैसे कार्बनिक अम्ल (organic acids) प्रदान किए जाते हैं, तो कोशिकाओं को एकमात्र N स्रोत के रूप में \(NH_4\) के साथ उगाया जा सकता है। इसके अलावा, \(NH_4\)-N की सांद्रता 8 mM से अधिक नहीं होनी चाहिए। आमतौर पर \(NO_3\)-N का उपयोग एकमात्र N स्रोत के रूप में किया जा सकता है, लेकिन यदि माध्यम में \(NH_4\)-N होता है तो अक्सर इसका लाभकारी प्रभाव होता है।
फास्फोरस (Phosphorus)
फास्फोरस की आपूर्ति आमतौर पर फॉस्फेट के रूप में की जाती है। यह ऊतक संवर्धन मीडिया में प्राथमिक बफरिंग घटक (primary buffering constituent) है। 2mM से अधिक फास्फोरस का स्तर अक्सर ऊतकों के विकास के लिए अवरोधक (inhibitory) होता है।
पोटेशियम (Potassium)
पोटेशियम की आवश्यक इष्टतम सांद्रता 20 mM है। कम नाइट्रोजन सांद्रता पर पोटेशियम की उपस्थिति दैहिक भ्रूण (somatic embryos) के निर्माण को बढ़ाती है। पोटेशियम नाइट्रेट के साथ पूरक माध्यम अमोनियम नाइट्रेट वाले माध्यम की तुलना में अधिक भ्रूण पैदा करता है।
सल्फर (Sulphur)
सल्फर की आपूर्ति सल्फेट्स के रूप में की जाती है। इसके अलावा, L-सिस्टीन (L-cysteine), L-मेथियोनीन (L-methionine) और ग्लूटाथियोन (glutathione) जैसे सल्फर युक्त अमीनो एसिड सल्फर के लिए संतोषजनक स्रोत हैं।
कैल्शियम और मैग्नीशियम (Calcium and Magnesium)
आवश्यक Ca की इष्टतम सांद्रता 3mM है। Ca और Mg के बीच एक विरोध (antagonism) प्रदर्शित किया गया है और यह पाया गया कि एक तत्व की सांद्रता में वृद्धि ने दूसरे की आवश्यकता को बढ़ा दिया।
सूक्ष्म तत्व अर्थात Fe, Mn, B, Zn, Mo, Cu, I और Co इन विट्रो में ऊतक की वृद्धि पर गहरा प्रभाव डालते हैं। उच्च pH पर अवक्षेपण (precipitation) के कारण आयरन की उपलब्धता कम हो जाती है। इससे बचने के लिए, Fe की आपूर्ति चेलेटेड (chelated) EDTA कॉम्प्लेक्स के रूप में की जाती है। यदि उन्हें उच्च स्तर पर लागू किया जाता है, तो ये तत्व विषाक्त प्रभाव (toxic effect) उत्पन्न करते हैं। ऊतक की अच्छी वृद्धि तब प्राप्त की जा सकती है जब सूक्ष्म तत्वों की सांद्रता मूल स्तर के 10 प्रतिशत तक कम कर दी जाए।
कार्बोहाइड्रेट (Carbohydrates)
कार्बोहाइड्रेट का उपयोग कार्बन स्रोतों के रूप में किया जाता है। मानक कार्बन स्रोत सुक्रोज (sucrose) 2-5 प्रतिशत की सांद्रता पर है। मोनोसैकराइड (Monosaccharides) जैसे ग्लूकोज या फ्रुक्टोज का उपयोग भी कार्बन स्रोतों के रूप में किया जा सकता है, लेकिन आम तौर पर कम उपयुक्त होते हैं। सुक्रोज सबसे अच्छा स्रोत है, क्योंकि ऑटोक्लेविंग (autoclaving) के दौरान सुक्रोज उपयोगी शर्करा में निर्जलित (dehydrolysed) हो जाता है।
विटामिन (Vitamins)
ऊतकों की सर्वोत्तम वृद्धि प्राप्त करने के लिए विटामिन को माध्यम के साथ पूरक किया जाता है। विटामिनों में केवल थायमिन HCL (Thiamine HCL - B1) सार्वभौमिक रूप से आवश्यक प्रतीत होता है। अन्य विटामिन पाइरिडोक्सिन HCL (Pyridoxine HCL - B6), निकोटिनिक एसिड (nicotinic acid - B3) और कैल्शियम पैंटोथेनेट (calcium pantothenate - B5) हैं। हर एक की विशिष्ट आवश्यकता संवर्धन के अधीन पौधे की प्रजातियों के साथ भिन्न होती है।
फाइटोहार्मोन
ये पोषक तत्वों के अलावा कार्बनिक यौगिक हैं, जो विकास, विभेदन और गुणन (multiplication) को प्रभावित करते हैं। उन्हें मीडिया में बहुत कम मात्रा में आवश्यक होती है। इन पदार्थों की आवश्यकता ऊतक के साथ काफी भिन्न होती है और यह उनके अंतर्जात स्तर (endogenous level) पर भी निर्भर करता है। कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिंथेटिक पदार्थ (synthetic substances) हैं जो कुछ प्रजातियों के लिए विशिष्ट PGR (Plant Growth Regulator) की नकल करते हैं। पादप ऊतक संवर्धन में एक नए PGR का उपयोग करने से पहले, एक नई प्रजाति के लिए ऊतक संवर्धन प्रोटोकॉल के विकास के दौरान विभिन्न प्रकारों, सांद्रताओं और विकास पदार्थों के मिश्रण का परीक्षण आवश्यक है।
मीडिया में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले PGRs के विभिन्न समूह हैं। वे ऑक्सिन (auxins), साइटोकिनिन (cytokinins), जिबरेलिन (gibberellins), एथिलीन (ethylene) और एब्सिसिक एसिड (abscisic acid) हैं। प्लांट टिशू कल्चर में हार्मोन के रूप में मान्यता प्राप्त करने वाले अतिरिक्त पदार्थ हैं: पॉलीमाइन्स (polyamines), जस्मोनैट्स (jasmonates), सैलिसिलिक एसिड (salicylic acid) और ब्रासिनोस्टेरॉइड्स (brassinosteroids)।
प्रकृति में, इस समूह के हार्मोन तने, पोरियों (internodes) के बढ़ाव, अनुवर्तन (tropism), शीर्षस्थ प्रभाविता (apical dominance), विगलन (abscission), जड़ निर्माण (rooting) आदि से जुड़े होते हैं। ऊतक संवर्धन में ऑक्सिन का उपयोग कोशिका विभाजन और जड़ विभेदन के लिए किया गया है। ऊतक संवर्धन में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले ऑक्सिन हैं:
ऑक्सिन आमतौर पर इथेनॉल या तनु (dilute) NaOH में घुले होते हैं।
ये हार्मोन कोशिका विभाजन, शीर्षस्थ प्रभाविता के संशोधन, प्ररोह (shoot) विभेदन आदि के लिए आवश्यक हैं। ऊतक संवर्धन मीडिया में, साइटोकिनिन मुख्य रूप से कोशिका विभाजन, कैलस से अपस्थानिक प्ररोहों (adventitious shoots) के विभेदन और अंग और प्ररोह प्रसार (proliferation) के लिए शामिल किए जाते हैं।
आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले साइटोकिनिन हैं:
साइटोकिनिन आमतौर पर तनु HCl या NaOH में घुले होते हैं।
प्राकृतिक रूप से पाए जाने वाले पादप हार्मोन जो पोरियों के बढ़ाव, फूल, फल और पत्ती के आकार में वृद्धि, अंकुरण (germination) और पौधों में वसंतीकरण (vernalization) में शामिल होते हैं। 20 ज्ञात जिबरेलिन में से, \(GA_3\) का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। ऑक्सिन और साइटोकिनिन की तुलना में, जिबरेलिन का बहुत कम उपयोग किया जाता है। वे इन विट्रो गठित अपस्थानिक भ्रूणों से छोटे पौधों (plantlets) के सामान्य विकास को उत्तेजित करते हैं। वे ठंडे पानी में घुलनशील होते हैं।
एक गैसीय पादप हार्मोन जो फल परिपक्वता (maturation), विगलन, और जीर्णता (senescence) में शामिल है। सभी प्रकार के पादप ऊतक संवर्धन एथिलीन का उत्पादन करते हैं और तनाव (stress) की स्थिति में उत्पादन की दर बढ़ जाती है। ऊतक संवर्धन में एथिलीन अग्रदूत (precursor) (2-क्लोरोइथाइलफोस्फोनिक एसिड) का उपयोग विभिन्न प्रजातियों में एक ही प्रक्रिया के लिए प्रमोटर या निरोधात्मक हो सकता है। उदाहरण के लिए, इसने ज़िया मेज़ (Zea mays) में दैहिक भ्रूणजनन को बढ़ावा दिया जबकि वही प्रक्रिया हेवेआ ब्रासिलिएन्सिस (Hevea brasiliensis) में बाधित हुई थी।
एक पादप हार्मोन जो विगलन, प्रसुप्ति (dormancy) को लागू करने और भ्रूण के विकास के प्रारंभिक चरणों को विनियमित करने में शामिल है। यह दैहिक भ्रूणों की सामान्य वृद्धि और विकास के लिए आवश्यक है और आकारजनन (morphogenesis) को बढ़ावा देता है।
यह कम सांद्रता पर प्ररोह के बढ़ाव को बढ़ावा देता है और जड़ की वृद्धि और विकास को दृढ़ता से रोकता है। यह एथिलीन जैवसंश्लेषण (biosynthesis) और एपिनास्टी (epinasty) को भी बढ़ावा देता है।
जस्मोनैट्स को जैस्मोनिक एसिड (jasmonic acid) द्वारा दर्शाया जाता है और यह एक मिथाइल एस्टर (methyl ester) है। जैस्मोनिक एसिड को पादप विकास पदार्थ का एक नया वर्ग माना जाता है। यह कई प्रक्रियाओं को रोकता है जैसे कि भ्रूणजनन, बीज अंकुरण, पराग अंकुरण (pollen germination), फूल की कली का निर्माण, क्लोरोफिल निर्माण। यह विभेदन, अपस्थानिक जड़ निर्माण, बीज प्रसुप्ति को तोड़ने और पराग अंकुरण में शामिल है।
इस बारे में कुछ विवाद है कि क्या इन यौगिकों को हार्मोन के साथ वर्गीकृत किया जाना चाहिए। वे वृद्धि और कोशिका विभाजन में आवश्यक प्रतीत होते हैं।
इसे पादप विकास पदार्थों का एक नया वर्ग माना जाता है। यह फूल आने को बढ़ावा देता है, एथिलीन जैवसंश्लेषण को रोकता है और ABA के प्रभावों को उलट देता है।
ऊतक संवर्धन मीडिया में योजक के रूप में ग्लूटामाइन (glutamine), एस्पैराजिन (asparagine) जैसे अमीनो एसिड और एडेनिन (adenine) जैसे नाइट्रोजन बेस का उपयोग किया जाता है। साइट्रेट, मैलेट, सक्सिनेट और फ्यूमरेट कार्बनिक अम्लों का उपयोग तब किया जाता है जब माध्यम में अमोनिया के रूप में नाइट्रोजन होता है।
मीडिया तैयार करने के दौरान नारियल पानी (तरल भ्रूणपोष), टमाटर और संतरे के रस जैसे जटिल प्राकृतिक अर्क (complex natural extracts) की एक विस्तृत विविधता का भी उपयोग किया जाता है। इन जटिल पदार्थों में वृद्धि को बढ़ावा देने वाले गुणों के साथ कई अमीनो एसिड, विटामिन, शर्करा, शुगर अल्कोहल, वृद्धि नियामक और अन्य अज्ञात पदार्थ होते हैं। हालांकि, इनकी अज्ञात और परिवर्तनशील संरचना के कारण इनसे बचना चाहिए। प्राकृतिक अर्क में साइटोकिनिन और विभिन्न अमीनो एसिड के स्रोत के रूप में नारियल पानी का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।
ऊतक संवर्धन मीडिया में अक्सर उपयोग किए जाने वाले अन्य जटिल पदार्थ हैं: कैसिइन हाइड्रोलाइज़ेट (casein hydrolysate), खमीर अर्क (yeast extract) और माल्ट अर्क (malt extract)। अनाज के परागकोष संवर्धन (cereal anther cultures) के लिए चीन में आलू के अर्क का भी उपयोग किया जाता है.
लाभ (Advantages)
हानियाँ (Disadvantages)
लाभ
हानियाँ
एक ऊतक संवर्धन माध्यम का भौतिक रूप, पोषक तत्वों के संयोजन की तरह ही अधिक महत्वपूर्ण है, क्योंकि ऊतकों द्वारा पोषक तत्वों का ग्रहण, उनकी वृद्धि और विकास उस पर निर्भर करता है। संवर्धन के लिए उपयुक्त माध्यम के भौतिक रूप को बनाए रखने के लिए, आवश्यक (1) हाइड्रोजन आयन सांद्रता, (2) गेलिंग एजेंट और (3) माध्यम का परासरण दाब बनाए रखने का ध्यान रखा जाना चाहिए।
अगर (agar) और ऑटोक्लेविंग को जोड़ने से पहले माध्यम का pH आमतौर पर 5.0 और 6.0 के बीच समायोजित किया जाता है। pH की चरम सीमा से बचा जाना चाहिए क्योंकि यह इनोक्यूलम (inoculum) के लिए कुछ पोषक तत्वों की उपलब्धता को अवरुद्ध करेगा। पादप ऊतक संवर्धन के लिए 5.8 का pH इष्टतम पाया गया है। आम तौर पर, 6.0 से अधिक pH एक बहुत ही कठोर माध्यम देता है और 5.0 से नीचे का pH अगर के संतोषजनक ठोसकरण (solidification) की अनुमति नहीं देता है। इसके अलावा, पादप ऊतकों के विकास के दौरान मीडिया में pH बदलता है और यह pH बहाव (drift) उच्च नमक सांद्रता वाले मीडिया में तुलनात्मक रूप से कम है, क्योंकि उनकी बफरिंग क्षमता अधिक है।
आम तौर पर ऊतक संवर्धन मीडिया को किसी भी गेलिंग एजेंट के साथ ठोस किया जाता है। अगर का व्यापक रूप से माध्यम को ठोस करने के लिए उपयोग किया जाता है। उपयोग किए जाने वाले अगर की इष्टतम सांद्रता 0.8-1.0 प्रतिशत (W/V) से होती है। यदि अगर की सांद्रता बढ़ा दी जाती है, तो माध्यम कठोर हो जाता है और ऊतकों में पोषक तत्व के प्रसार की अनुमति नहीं देता है। जिलेटिन (Gelatin), सिलिका जेल (silica gel), एक्रिल एमाइड जेल (acryl amide gel) और स्टार्च कॉपोलिमर (starch copolymers) का उपयोग अगर के विकल्प के रूप में भी किया जाता है। कभी-कभी, ठोस मीडिया ऊतकों से जारी विषैले पदार्थों अर्थात् ऑक्सीकृत, फेनोलिक यौगिकों (phenolic compounds) को जमा करेगा और ऊतक के आगे के विकास में बाधा उत्पन्न करेगा। विषैले पदार्थों को अवशोषित करने के लिए, माध्यम में 1 प्रतिशत सक्रिय चारकोल (activated charcoal) मिलाया जाता है। सक्रिय चारकोल को जोड़ने का एक नुकसान यह है कि यह वृद्धि नियामकों (growth regulators) को अधिशोषित (adsorb) कर लेगा।
तरल माध्यम (बिना किसी गेलिंग एजेंट के माध्यम) निलंबन संवर्धन (suspension culture) के लिए उपयुक्त है और यह निम्नलिखित कारणों से अन्य मीडिया से श्रेष्ठ है: 1) इसमें अगरिफाइड माध्यम की तरह अशुद्धियाँ नहीं होती हैं जहाँ अगर में अशुद्धियाँ होती हैं, 2) निलंबन को लगातार हिलाकर कोशिकाओं को वातन प्रदान किया जा सकता है और 3) ऊतकों से निकलने वाले विषैले पदार्थ जमा या स्थानीय नहीं होंगे; पदार्थ पतले (diluted) हो जाते हैं। तरल मीडिया संवर्धन में, संवर्धन ऊतक का समर्थन करने के लिए फिल्टर पेपर ब्रिज या ग्लास वूल का उपयोग किया जा सकता है।
इन विट्रो में संवर्धित कोशिका ज्यादातर परासरणी (osmotically) रूप से नाजुक होती है और इसलिए माध्यम के परासरण दाब को इष्टतम स्तर पर बनाए रखा जाना चाहिए। तरल मीडिया का उपयोग करने पर यह समस्या गंभीर हो जाती है। परासरण दाब को समायोजित करने के लिए, स्टेबलाइजर्स जिन्हें अन्यथा ओस्मोटिकम (osmoticums) अर्थात, सोर्बिटोल (sorbitol) और मैनिटोल (mannitol) (शुगर अल्कोहल) कहा जाता है, उपयोग किए जाते हैं। ये गैर-चयापचय शर्करा (non-metabolisable sugars) हैं। घुलनशील शर्करा जैसे सुक्रोज, फ्रुक्टोज, गैलेक्टोज आदि भी प्रभावी हैं। सुक्रोज को माध्यम में न केवल ऊर्जा प्रदान करने के लिए बल्कि माध्यम में उपयुक्त परासरणता (osmolarity) बनाए रखने के लिए भी जोड़ा जाता है।
विभिन्न प्रकार के पादप ऊतक संवर्धन के लिए विकसित बुनियादी मीडिया में कई संशोधन किए गए हैं और पादप ऊतक संवर्धन के क्षेत्र में संशोधन निरंतर प्रक्रियाएं हैं। इसके पीछे कारण यह है कि किसी विशेष प्रजाति के लिए किसी विशेष संवर्धन माध्यम का चयन मुश्किल है। कठिनाइयों को ध्यान में रखते हुए काम के लिए एक उपयुक्त माध्यम की पहचान करने के लिए निम्नलिखित दृष्टिकोणों पर विचार किया जा सकता है: 1) समान उद्देश्यों या निकट संबंधी प्रजातियों पर काम के लिए साहित्य सर्वेक्षण और रिपोर्टों में मीडिया को आजमाना, 2) कुछ चरों को शामिल करते हुए कई प्रसिद्ध मीडिया के साथ प्रयोग करना और 3) विभिन्न उपचारों के साथ अधिकांश घटकों (खनिज, कार्बन स्रोत और फाइटोहार्मोन) को शामिल करते हुए व्यापक स्पेक्ट्रम प्रयोग करना। वांछित प्रतिक्रिया प्राप्त होने पर उपयुक्त संयोजनों की पहचान की जा सकती है।
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