इन विट्रो कल्चर्स की तकनीकें (Techniques of in vitro cultures)

इन विट्रो (in vitro) अध्ययन में कई शब्दों का उपयोग किया जाता है। उदाहरण के लिए, विभेदीकरण (differentiation), निर्विभेदीकरण (de-differentiation), पुनर्विभेदीकरण (re-differentiation), पुनर्जनन (regeneration) और आकारजनन (morphogenesis) ऐसे शब्द हैं जिनके अर्थ एक-दूसरे से मिलते-जुलते हैं। इन शब्दों के उपयोग को स्पष्ट करने के लिए, उनके बीच के मुख्य अंतर नीचे दिए गए हैं।

विभेदीकरण

जीव विज्ञान (biology) में विभेदीकरण शब्द का उपयोग कई अर्थों में किया जाता है। व्यापक अर्थ में, इसे उस प्रक्रिया के रूप में परिभाषित किया जाता है जिसके द्वारा विभज्योतकी कोशिकाएं (meristematic cells) दो या अधिक प्रकार की कोशिकाओं, ऊतकों (tissues) या अंगों (organs) में बदल जाती हैं जो गुणात्मक (qualitatively) रूप से एक-दूसरे से भिन्न होते हैं।

निर्विभेदीकरण

इस शब्द का उपयोग अत्यधिक संगठित ऊतकों (highly organised tissues) से असंगठित ऊतकों (unorganized tissues) के निर्माण की प्रक्रिया को दर्शाने के लिए किया जाता है।

पुनर्विभेदीकरण

अविभेदित ऊतक (undifferentiated tissue) में होने वाली विभेदीकरण की प्रक्रिया को पुनर्विभेदीकरण कहते हैं।

पुनर्जनन

इसे किसी भी अंग के निर्माण के रूप में परिभाषित किया जाता है जिसे जीव से हटा दिया गया है या शारीरिक रूप से अलग कर दिया गया है। दूसरे शब्दों में, संवर्धित एक्सप्लांट्स (cultured explants) से सीधे या कैलस (callus) के माध्यम से अप्रत्यक्ष रूप से एक पूरे पौधे (plant) के निर्माण को पुनर्जनन कहा जाता है।

आकारजनन

जैविक संगठन (biological organization) या रूप (form) प्राप्त करने को आकारजनन कहा जाता है। इन विट्रो परिस्थितियों में इसे दो तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है: 1. संवर्धित ऊतकों (cultured tissues) से अंगों (जैसे प्ररोह (shoots) या जड़ें (roots)) की नए सिरे से (de novo) उत्पत्ति, जिसे अंगजनन (organogenesis) कहा जाता है। 2. दैहिक कोशिकाओं (somatic cells) या इन विट्रो में संवर्धित कोशिकाओं से दोनों सिरों पर अलग-अलग जड़ और प्ररोह ध्रुवों (poles) वाले भ्रूणों (embryos) की नए सिरे से उत्पत्ति, जिसे दैहिक भ्रूणजनन (somatic embryogenesis) कहा जाता है।

अंगजनन

प्लांट टिश्यू कल्चर (plant tissue culture) में, अंगजनन का अर्थ प्ररोह, जड़ों, पत्तियों (leaves), फूलों (flowers) आदि जैसे अंगों का निर्माण है। इन विट्रो में प्ररोह अंगजनन के प्रेरण (induction) पर पहली रिपोर्ट व्हाइट (White, 1939) द्वारा तंबाकू संकर (tobacco hybrid) का उपयोग करके दी गई थी; और जड़ निर्माण का पहला अवलोकन नोबेकोर्ट (Nobecourt, 1939) द्वारा गाजर (carrot) कैलस का उपयोग करके बताया गया था। 1950 के दशक के अंत तक, अंगजनन में अंतर्निहित मूल नियामक तंत्र (regulatory mechanism) की पहचान नहीं की गई थी। स्कूग और मिलर (Skoog and Miller, 1957) ने नियामक तंत्र को ऑक्सिन (auxin) और साइटोकाइनिन (cytokinin) के बीच संतुलन के रूप में पहचाना। उनके निष्कर्ष के अनुसार, साइटोकाइनिन की तुलना में ऑक्सिन का अपेक्षाकृत उच्च स्तर जड़ निर्माण के पक्ष में था और इसके विपरीत प्ररोह निर्माण के पक्ष में था। इस अवधारणा का उपयोग करके, अब एक परिभाषित माध्यम (defined medium) में एक्सप्लांट्स, कैली (calli) और सेल सस्पेंशन (cell suspension) का संवर्धन करके बड़ी संख्या में पौधों की प्रजातियों (plant species) में अंगजनन प्राप्त करना संभव हो गया है।

अंगजनन में, बेसल माध्यम (basal medium) में विकास हार्मोन (growth hormones) की प्रकृति के आधार पर प्ररोह या जड़ पहले बन सकती है। एक्सप्लांट्स या कैली से प्ररोह और जड़ की उत्पत्ति को क्रमशः कॉलोजेनेसिस (caulogenesis) और राइजोजेनेसिस (rhizogenesis) कहा जाता है।

अंगजनन या डी नोवो पुनर्जनन (de novo regeneration) को संवर्धित कोशिकाओं या ऊतकों से प्ररोह, जड़, फूल की कलियों, दैहिक भ्रूण आदि जैसी संगठित संरचनाओं के विकास के रूप में संदर्भित किया जाता है। डी नोवो अंगजनन जो संपूर्ण पौधे के पुनर्जनन की ओर ले जाता है, एक बहु-स्तरीय प्रक्रिया है जिसमें कम से कम तीन अलग-अलग चरण होते हैं:

1. प्ररोह कली (shoot bud) का निर्माण
2. प्ररोह का विकास और गुणन (multiplication)
3. विकसित प्ररोहों का जड़ना (rooting)

कॉलोजेनेसिस एक प्रकार का अंगजनन है जिसके द्वारा कैलस ऊतक में केवल अपस्थानिक प्ररोह कली (adventitious shoot bud) की शुरुआत होती है। जब अंगजनन जड़ विकास की ओर ले जाता है, तो इसे राइजोजेनेसिस कहा जाता है। अंगजनन के दौरान विकसित असामान्य संरचनाओं को ऑर्गेनोइड्स (organoids) कहा जाता है। कैलस पर स्थित विभज्योतकी कोशिकाएं जो प्ररोह और/या जड़ों को जन्म देती हैं, मेरिस्टेमॉइड्स (meristemoids) कहलाती हैं।

मेरिस्टेमॉइड्स को विभज्योतक (meristem) जैसी कोशिकाओं के एकत्रीकरण कहते हैं। ये सीधे एक्सप्लांट पर या अप्रत्यक्ष रूप से कैलस के माध्यम से हो सकते हैं।

इस प्रकार, अंगजनन दो प्रकार के होते हैं। एक विकासात्मक क्रम जिसमें मध्यवर्ती कैलस (intervening callus) चरण शामिल होता है, उसे 'अप्रत्यक्ष (indirect)' अंगजनन कहा जाता है:

प्राथमिक एक्सप्लांट (Primary explant) → कैलस → मेरिस्टेमॉइड (meristemoid) → अंग आद्यक (organ primordium)

प्रत्यक्ष (Direct) अंगजनन बिना किसी मध्यवर्ती प्रोलिफरेट कैलस चरण के पूरा होता है:

प्राथमिक एक्सप्लांट → मेरिस्टेमॉइड → अंग आद्यक

इन विट्रो में पौधों के ऊतक कई प्रकार के प्राइमोर्डिया (primordia) (अपस्थानिक कलियां और अंग) उत्पन्न कर सकते हैं, जिनमें वे भी शामिल हैं जो अंततः भ्रूण, फूल, पत्तियां, प्ररोह और जड़ों में विभेदित हो जाएंगे। ये प्राइमोर्डिया सेलुलर निर्विभेदीकरण (cellular dedifferentiation) प्रक्रिया से नए सिरे से उत्पन्न होते हैं, जिसके बाद घटनाओं की एक श्रृंखला शुरू होती है जो एक अंग के रूप में परिणत होती है।

कल्चर्स के प्रकार (Types of cultures)

अंग संवर्धन (Organ cultures): कृत्रिम मीडिया में नियंत्रित परिस्थितियों में जड़ों, तनों या पत्तियों जैसे पृथक अंगों या ऊतकों को संवर्धित करने को अंग संवर्धन कहा जाता है। कल्चर स्थापित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अंगों या ऊतक के प्रकार के आधार पर, अंग कल्चर्स के नाम रखे जाते हैं। निम्नलिखित विभिन्न प्रकार के अंग संवर्धन और उनके विशिष्ट उद्देश्य हैं:

• बीज संवर्धन (Seed culture): विवो (in vivo) में अंकुरित होने में कठिन बीजों के अंकुरण (germination) की दक्षता बढ़ाना, पादप वृद्धि नियामकों (plant-growth regulators) के उपयोग द्वारा अकाल अंकुरण (precocious germination), और एक्सप्लांट्स या मेरिस्टेम कल्चर के लिए स्वच्छ पौधों का उत्पादन।
• भ्रूण संवर्धन (Embryo culture): असंगति बाधाओं (incompatibility barriers) के कारण भ्रूण के गर्भपात (embryo abortion) को दूर करना, बीजों की प्रसुप्ति (seed dormancy) और स्व-बांझपन (self-sterility) को दूर करना, और दूरस्थ (अंतरविशिष्ट या अंतर्वंशीय) संकरण (distant hybridization) में भ्रूण बचाव (embryo rescue) जहां भ्रूणपोष (endosperm) का विकास खराब होता है, प्रजनन चक्र (breeding cycle) को छोटा करना आदि।
• अंडाशय या बीजांड संवर्धन (Ovary or ovule culture): दैहिक भ्रूणजनक संवर्धनों (somatic embryogenic cultures) की शुरुआत के लिए एक सामान्य एक्सप्लांट, अगुणित पौधों (haploid plants) के उत्पादन के लिए, असंगति बाधाओं के कारण विकास के बहुत प्रारंभिक चरणों में व्यापक संकर (wide hybrids) के भ्रूणों के गर्भपात को दूर करने के लिए, और दूरस्थ संकरों के उत्पादन के लिए इन विट्रो निषेचन (in vitro fertilization) जो शैली (style) और वर्तिकाग्र (stigmatic) असंगति से बचता है जो पराग अंकुरण (pollen germination) और पराग नली (pollen tube) के विकास को रोकता है।
• परागकोश और सूक्ष्मबीजाणु संवर्धन (Anther and microspore culture): अगुणित पौधों का उत्पादन, गुणसूत्र दोहरीकरण (chromosome doubling) के माध्यम से समयुग्मजी द्विगुणित लाइनों (homozygous diploid lines) का उत्पादन, इस प्रकार इनब्रेड लाइनों (inbred lines) का उत्पादन करने के लिए आवश्यक समय को कम करना, और उत्परिवर्तन (mutations) या अप्रभावी फेनोटाइप (recessive phenotypes) को उजागर करने के लिए।

एक्सप्लांट संवर्धन (Explant culture)

एक्सप्लांट संवर्धन वास्तव में ऊतक संवर्धन (tissue culture) है। पत्ती के ऊतक, तने के हिस्से, बीजपत्र (cotyledon), हाइपोकोटाइल (hypocotyls), जड़ के हिस्से आदि जैसे किसी भी कटे हुए ऊतक या पौधे के हिस्सों का संवर्धन एक्सप्लांट संवर्धन कहलाता है। एक्सप्लांट संवर्धन का प्राथमिक उद्देश्य कैलस संवर्धन को प्रेरित करना है या बिना कैलस के निर्माण के सीधे उससे पूरे पौधों का पुनर्जनन करना है। प्ररोह शीर्ष मेरिस्टेम (Shoot apical meristem) संवर्धन एक उदाहरण है, और इसके महत्वपूर्ण उपयोग निम्नलिखित हैं: वायरस-मुक्त जर्मप्लाज्म (virus-free germplasm) या छोटे पौधों का उत्पादन, वांछनीय जीनोटाइप का बड़े पैमाने पर उत्पादन, स्थानों के बीच विनिमय की सुविधा (स्वच्छ सामग्री का उत्पादन), और क्रायोप्रिजर्वेशन (cryopreservation) (कोल्ड स्टोरेज) या जर्मप्लाज्म का इन विट्रो संरक्षण, आदि मेरिस्टेम या प्ररोह शीर्ष संवर्धन के मुख्य उद्देश्य हैं।

कैलस संवर्धन (Callus culture)

कैलस कोशिकाओं के असंगठित या अविभेदित द्रव्यमान (mass) का प्रतिनिधित्व करता है। वे आम तौर पर पैरेन्काइमेटस (parenchymatous) कोशिकाओं से बने होते हैं और आमतौर पर विभाजित होते हैं। जब एक एक्सप्लांट को पर्याप्त मात्रा में ऑक्सिन के साथ संवर्धित किया जाता है, तो यह एक्सप्लांट की सतह से कोशिकाओं का द्रव्यमान बनाना शुरू कर देता है। प्रत्येक प्रकार के एक्सप्लांट के लिए आवश्यक ऑक्सिन की सांद्रता (concentration) अलग-अलग होगी और मुख्य रूप से एक्सप्लांट ऊतक की शारीरिक स्थिति (physiological state) पर निर्भर करती है। कैलस संवर्धनों को ताजे माध्यम में रुक-रुक कर उप-संवर्धन (sub-culturing) करके बहुत लंबे समय तक बनाए रखा जा सकता है। मीडिया में हार्मोन सांद्रता को बदलकर विभिन्न उद्देश्यों के लिए कैलस संवर्धनों में संशोधन किया जा सकता है। छोटे पौधों के पुनर्जनन, एकल कोशिकाओं (single cells) या निलंबन संवर्धन (suspension cultures) की तैयारी, या प्रोटोप्लास्ट (protoplasts) तैयारी के लिए कैलस संवर्धनों का उपयोग किया जा सकता है। आनुवंशिक परिवर्तन (genetic transformation) अध्ययन के लिए भी कैलस संवर्धनों का उपयोग किया जा सकता है। कुछ मामलों में, दैहिक भ्रूणजनन या अंगजनन के माध्यम से पुनर्जनन से पहले कैलस चरण से गुजरना आवश्यक होता है। कैलस संवर्धन उपयोगी सोमाक्लोनल वेरिएंट (somaclonal variants) (आनुवंशिक या एपिजेनेटिक) के निर्माण के लिए उपयुक्त हैं और इसका उपयोग कोशिकाओं और ऊतक वेरिएंट के इन विट्रो चयन के लिए किया जा सकता है।

कोशिका-निलंबन संवर्धन (Cell-suspension cultures)

कैलस ऊतक के एक टुकड़े को तरल माध्यम (liquid medium) में स्थानांतरित करके और इसे लगातार हिलाकर कैलस संवर्धनों से एकल-कोशिका संवर्धन और निलंबन संवर्धन स्थापित किए जा सकते हैं। निलंबन-संवर्धित कोशिकाओं की विकास दर (growth rate) आमतौर पर ठोस संवर्धन की तुलना में अधिक होती है। पूर्व अधिक वांछनीय है, विशेष रूप से बड़े पैमाने पर उपयोगी चयापचयों (metabolites) के उत्पादन के लिए। कैलस के एक टुकड़े को एर्लेनमेयर फ्लास्क (Erlenmeyer flask) जैसे बर्तन में तरल माध्यम में स्थानांतरित किया जाता है और बर्तन को रोटरी (rotary) या रेसिप्रोकल शेकर (reciprocal shaker) पर रखा जाता है। संवर्धन की स्थिति पौधों की प्रजातियों और अन्य कारकों पर निर्भर करती है, लेकिन सामान्य तौर पर, कोशिकाओं को रोटरी शेकर पर 100 rpm और 25°C पर संवर्धित किया जाता है। कई पीढ़ियों के उप-संवर्धन द्वारा, एक महीन कोशिका निलंबन संवर्धन जिसमें छोटे-कोशिका समुच्चय (small-cell aggregates) और एकल कोशिकाएं होती हैं, स्थापित की जाती है।

कोशिका-निलंबन संवर्धन को स्थापित करने के लिए आवश्यक समय काफी भिन्न होता है और पौधे की प्रजातियों के ऊतकों और मध्यम संरचना (medium composition) पर निर्भर करता है। निलंबन में कोशिकाओं का उपयोग जार-किण्वकों (jar-fermentors) और टैंकों (tanks) के साथ बड़े पैमाने पर संवर्धन के लिए भी किया जाता है। फाइटोकेमिकल्स (phytochemicals) के उत्पादन के लिए निलंबन संवर्धनों को बैच संवर्धन (batch cultures) या निरंतर संवर्धन (continuous cultures) के रूप में विकसित किया जा सकता है। एक महीन कोशिका-निलंबन संवर्धन स्थापित करने के लिए एंजाइमेटिक तरीकों (Enzymatic methods) को भी अपनाया जा सकता है। यह संवर्धन माध्यम में पेक्टिन (pectin) पचाने वाले कुछ एंजाइमों, जैसे पेक्टिनेज (pectinase) या मैसेरोजाइम (macerozyme) के उपयोग पर आधारित है। ये एंजाइम पेक्टिन पर कार्य करते हैं, जो पौधों के ऊतकों में दो आसन्न कोशिकाओं को जोड़ता है, जिससे कोशिकाएं स्वतंत्र हो जाती हैं और एकल कोशिकाओं के रूप में स्वतंत्र रूप से बढ़ती हैं। कोशिका-निलंबन संवर्धनों का उपयोग दैहिक भ्रूणजनन को प्रेरित करने और कृत्रिम बीजों (artificial seeds) की तैयारी, दैहिक उत्परिवर्तन (somatic mutation) के प्रेरण, और माइक्रोबियल संवर्धनों की तरह कोशिकाओं की स्क्रीनिंग (screening) करके म्यूटेंट (mutants) के चयन के लिए किया जा सकता है। पादप कोशिका-निलंबन संवर्धनों का मुख्य अनुप्रयोग यह है कि इसका उपयोग जैव रासायनिक इंजीनियरिंग (biochemical engineering) के सिद्धांत को लागू करके कुछ महत्वपूर्ण फाइटोकेमिकल्स या द्वितीयक चयापचयों (secondary metabolites) के जैव-उत्पादन (bioproduction) के लिए किया जा सकता है। निलंबन संवर्धनों को औद्योगिक पैमाने पर पौधों के द्वितीयक चयापचयों के उत्पादन के लिए बड़े पैमाने पर कोशिका संवर्धनों के लिए एयरलिफ्ट बायोरिएक्टर (airlift bioreactors) नामक विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए बायोरिएक्टरों में संवर्धित किया जा सकता है। यांत्रिक स्टिरर (mechanical stirrer) वाले सामान्य बायोरिएक्टर का उपयोग प्लांट-कोशिका संवर्धनयों में नहीं किया जा सकता क्योंकि इसके परिणामस्वरूप कोशिकाएं टूट सकती हैं और जिससे कोशिका जीवनक्षमता (cell viability) काफी कम हो सकती है। जबकि एयरलिफ्ट बायोरिएक्टर ऑक्सीजन की उच्च मांग को पूरा करने के लिए स्टिरिंग और वायु प्रवाह (air inflow) दोनों प्रदान कर सकता है। कोशिकाओं का उपयोग ट्रांसजेनिक पौधों (transgenic plants) का उत्पादन करने के लिए आनुवंशिक परिवर्तन प्रयोगों (genetic transformation experiments) के लिए भी किया जा सकता है।

प्रोटोप्लास्ट संवर्धन (Protoplast cultures)

प्रोटोप्लास्ट कोशिका भित्ति (cell walls) के बिना पादप कोशिकाएं हैं। एंजाइमेटिक विधि (enzymatic method) से कोशिका भित्ति को हटाया जा सकता है। कोशिकाएं पत्ती के ऊतकों से या पौधे के किसी अन्य भाग से हो सकती हैं या निलंबन संवर्धनों की कोशिकाएं हो सकती हैं। इन कोशिकाओं को एक विशिष्ट समय के लिए सेल्युलेस (cellulase), हेमिसेल्युलेस (hemicellulase), और पेक्टिनेज से युक्त एक एंजाइम मिश्रण में इनक्यूबेट (incubate) किया जाता है। एंजाइम मिश्रण कोशिका भित्ति पर कार्य करता है और पूरी तरह से पच जाता है, जिससे अंतर्निहित कोशिका झिल्ली (cell membrane) उजागर हो जाती है। उचित माध्यम में संवर्धन करने पर यह प्रोटोप्लास्ट अपनी कोशिका भित्ति को पुनर्जीवित (regenerate) करेगा और एक सामान्य कोशिका बन जाएगा और फिर एक पूरे पौधे में पुनर्जीवित हो सकता है। पौधे के प्रोटोप्लास्ट का उपयोग विभिन्न जैव रासायनिक और चयापचय अध्ययनों के लिए किया जा सकता है और इसका उपयोग दैहिक संकर (somatic hybrids) बनाने के लिए दैहिक कोशिका संलयन (somatic cell fusion) के लिए किया जा सकता है। केन्द्रकहीन (aenucleated) और केन्द्रकयुक्त (nucleated) प्रोटोप्लास्ट के संलयन के परिणामस्वरूप एक विशेष प्रकार के दैहिक संकर बन सकते हैं जिन्हें साइब्रिड (cybrids) कहते हैं, जिसमें केन्द्रक (nucleus) का कोई संलयन नहीं होता है, बल्कि साइटोप्लाज्म (cytoplasm) के बीच संलयन होता है। बायोलिस्टिक तरीकों (biolistic methods), इलेक्ट्रोपोरेशन (electroporation) तकनीकों, PEG-मध्यस्थता वाले DNA स्थानांतरण या माइक्रो-सिरिंज (micro-syringes) का उपयोग करके प्रोटोप्लास्ट के केन्द्रक में DNA के सीधे इंजेक्शन द्वारा आनुवंशिक परिवर्तन अध्ययनों के लिए भी प्रोटोप्लास्ट का उपयोग किया जा सकता है।

पौधों के पुनर्जनन मार्ग (Plant regeneration pathways)

संपूर्ण पौधे के पुनर्जनन की दो विधियाँ हैं: अंगजनन और दैहिक भ्रूणजनन।

अंगजनन

यह पुनर्जनन का एक प्रमुख मार्ग है जिसमें प्ररोह (shoot) और जड़ों जैसे अंगों में संवर्धित कोशिकाओं या कैलस ऊतक का विभेदीकरण शामिल है। प्ररोहों और जड़ों के निर्माण के माध्यम से पौधों के पुनर्जनन को अंगजनन के माध्यम से पौधे के पुनर्जनन कहते हैं। माध्यम के हार्मोनल संयोजन और एक्सप्लांट्स की शारीरिक स्थिति के आधार पर अंगजनन सीधे एक्सप्लांट्स से हो सकता है। मिलर और स्कूग ने प्रदर्शित किया कि संवर्धित कैलस या एक्सप्लांट ऊतक पर जड़ों या प्ररोहों का प्रारंभिक निर्माण कल्चर मीडिया में ऑक्सिन (auxins) और साइटोकाइनिन (cytokinins) की सापेक्ष सांद्रता (relative concentration) पर निर्भर करता है। अपेक्षाकृत उच्च ऑक्सिन सांद्रता के साथ पूरक माध्यम एक्सप्लांट्स पर जड़ निर्माण को बढ़ावा देगा और उच्च साइटोकाइनिन सांद्रता प्ररोह विभेदीकरण को बढ़ावा देगी। टिश्यू कल्चर प्रथाओं में ऑक्सिन और साइटोकाइनिन के सापेक्ष संयोजन में तीन प्रकार के माध्यम हो सकते हैं, जो या तो प्ररोह निर्माण या जड़ निर्माण या दोनों को एक साथ बढ़ावा देते हैं। बाद के मामले में, आप प्ररोह और जड़ दोनों वाले पूर्ण पौधे (plantlets) प्राप्त कर सकते हैं, जिन्हें सीधे ग्रीनहाउस (greenhouse) में गमलों में स्थानांतरित किया जा सकता है। जबकि अन्य मामलों में, प्ररोहों के निर्माण के बाद, व्यक्तिगत प्ररोहों को रूटिंग माध्यम (rooting medium) में स्थानांतरित किया जाता है, जो जड़ निर्माण को बढ़ावा देते हैं। जड़े हुए पौधों को अनुकूलन (acclimatization) के लिए ग्रीनहाउस में स्थानांतरित किया जा सकता है। अंगजनन के माध्यम से पौधों के पुनर्जनन का उपयोग आमतौर पर बड़े पैमाने पर गुणन (mass multiplication), सूक्ष्म प्रवर्धन (micropropagation), और सामान्य या उप-शून्य तापमान (subzero temperatures) (क्रायोप्रिजर्वेशन) पर जर्मप्लाज्म के संरक्षण के लिए किया जाता है।

दैहिक भ्रूणजनन

यह विशिष्ट पौधों के सूक्ष्म प्रवर्धन या बड़े पैमाने पर गुणन के लिए पौधों के पुनर्जनन और विकास का एक और प्रमुख मार्ग है। कोशिकाएं, एक विशेष हार्मोनल संयोजन (hormonal combination) के तहत, जाइगोट्स (zygotes) (दैहिक जाइगोट्स) के समान शारीरिक स्थिति में बदल जाती हैं और दैहिक भ्रूण (somatic embryos) बनाने के लिए विकास के भ्रूणीय (embryonic) मार्ग का अनुसरण करती हैं। ये दैहिक भ्रूण यौन निषेचन (sexual fertilization) द्वारा गठित जाइगोट्स से विकसित सामान्य भ्रूणों (बीज भ्रूण) के समान होते हैं। दैहिक भ्रूण एक पूर्ण पौधे के रूप में विकसित हो सकते हैं। चूंकि दैहिक भ्रूण एक पूर्ण पौधे में अंकुरित हो सकते हैं, इनका उपयोग कृत्रिम बीजों के उत्पादन के लिए किया जा सकता है। ऊतक या कोशिका संवर्धन द्वारा विकसित दैहिक भ्रूणों को कैल्शियम एल्गिनेट (calcium alginate) जैसे कुछ निष्क्रिय पॉलिमर (inert polymers) में फंसाया जा सकता है और कृत्रिम बीज के रूप में उपयोग किया जा सकता है। चूंकि कृत्रिम बीज का उत्पादन मशीनीकरण और बायोरिएक्टर के लिए अनुकूल है, इसलिए इसका उत्पादन बड़ी संख्या में किया जा सकता है।

भ्रूणजनन (Embryogenesis)

भ्रूणों को दो श्रेणियों में वर्गीकृत किया गया है: जाइगोटिक भ्रूण (zygotic embryos) और गैर-जाइगोटिक भ्रूण (non-zygotic embryos)।

जाइगोटिक भ्रूणजनन (Zygotic embryogenesis)

जाइगोट्स (अंडे के नियमित संलयन के परिणामस्वरूप) से विकसित होने वाले भ्रूणों को जाइगोटिक भ्रूण या अक्सर केवल भ्रूण कहा जाता है।

गैर-जाइगोटिक भ्रूणजनन (Non-zygotic embryogenesis)

आमतौर पर गैर-जाइगोटिक भ्रूण जाइगोट के अलावा अन्य कोशिकाओं से बनते हैं। उदा. पर्थेनोजेनेटिक भ्रूण (Parthenogenetic embryos) - बिना निषेचित अंडे (unfertilized eggs) या कैरियोगैमी (karyogamy) के बिना निषेचित अंडे से बनते हैं। एंड्रोजेनेटिक भ्रूण (Androgenetic embryos) - माइक्रोस्पोर (microspores), माइक्रोगेमेटोफाइट्स (micro-gametophytes) या शुक्राणु (sperm) से बनते हैं। दैहिक भ्रूण (जिन्हें भ्रूणाभ (embryoids), सहायक भ्रूण (accessory embryos), अपस्थानिक भ्रूण (adventitious embryos) और अतिरिक्त भ्रूण (supernumerary embryos) भी कहा जाता है) - विवो या इन विट्रो में दैहिक कोशिकाओं द्वारा बनते हैं।

एक दैहिक भ्रूण एक ऐसा भ्रूण है जो जाइगोट के अलावा एक दैहिक कोशिका से, आमतौर पर इन विट्रो संवर्धन पर प्राप्त होता है। दैहिक भ्रूण विकास की प्रक्रिया को दैहिक भ्रूणजनन कहा जाता है।

दैहिक भ्रूणाभ के विकास के चरण (Stages in development of somatic embryoids)

कई प्रजातियों के लिए दैहिक भ्रूणजनन के माध्यम से पादप पुनर्जनन को दो चरणों में विभाजित किया जा सकता है: 1. भ्रूणजननिक क्षमता (embryogenic competence) वाली कोशिकाओं का चयन और प्रेरण 2. इन कोशिकाओं का भ्रूणों में विकास।

दैहिक भ्रूण आम तौर पर एकल कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं जो विभज्योतकी कोशिकाओं का एक समूह बनाने के लिए विभाजित होते हैं। आमतौर पर, यह बहु-कोशिकीय (multi-cellular) समूह अपने आस-पास की अन्य कोशिकाओं के साथ साइटोप्लाज्मिक कनेक्शन (cytoplasmic connections) को तोड़कर और बाद में इस विभेदित कोशिका द्रव्यमान (differentiating cell mass) की बाहरी दीवारों के क्युटिनाइजेशन (cutinization) द्वारा अलग हो जाता है। मेरिस्टेमेटिक द्रव्यमान की कोशिकाएं विभाजित होकर गोलाकार (globular), हृदय के आकार (heart-shaped), टारपीडो (torpedo) और बीजपत्र (cotyledonary) चरणों को जन्म देती हैं। दैहिक भ्रूणजनन कोशिकाओं के सक्रिय विभाजन (active division) के साथ शुरू होता है जिससे आकार में वृद्धि होती है लेकिन गोलाकार आकार (spherical shape) बरकरार रहता है। इस स्तर पर प्राथमिक मेरिस्टेम (primary meristem) (प्रोटोडर्म, ग्राउंड मेरिस्टेम और प्रोकैंबियम) दिखाई देने लगता है। इस चरण के बाद, कैलस विभाजित होना जारी रखता है और बीजपत्र प्राइमोर्डिया (cotyledon primordia) की शुरुआत के साथ हृदय के आकार के भ्रूण में विभेदित हो जाता है। जैसे-जैसे बीजपत्र विकसित होता है, भ्रूण टारपीडो के आकार के चरण में गुजरता है। बीजपत्र वलय (cotyledonary ring) के अंदर की कोशिकाएं प्ररोह और जड़ शीर्ष मेरिस्टेम (root apical meristem) बनाने के लिए विभाजित होती हैं और प्रोकैंबियम विभेदीकरण (procambium differentiation) होता है। सामान्य तौर पर, दैहिक भ्रूण विकास की आवश्यक विशेषताएं, विशेष रूप से गोलाकार चरण के बाद, जाइगोटिक भ्रूण के बराबर होती हैं।

दैहिक भ्रूणजनन से एक द्विध्रुवी संरचना (bipolar structure) का उत्पादन होता है जिसमें एक बंद स्वतंत्र संवहनी प्रणाली (independent vascular system) के साथ जड़/प्ररोह अक्ष (मूल/प्रांकुर) (radicle/plumule) होता है। मूल (radicular) सिरा हमेशा कोशिका द्रव्यमान से बाहर निकलता है। इसके विपरीत, एक प्ररोह कली एकध्रुवीय (monopolar) होती है क्योंकि इसमें मूल सिरा नहीं होता है।

दैहिक भ्रूण असामान्य विकासात्मक विशेषताएं दिखाते हैं, उदा. 3 या अधिक बीजपत्र (cotyledons), घंटी के आकार का बीजपत्र, बड़ा आकार आदि; इन समस्याओं को अक्सर ABA की उपस्थिति या मैनीटोल (mannitol) की उपयुक्त सांद्रता से दूर किया जाता है। कुछ प्रजातियों में सामान्य दिखने वाले दैहिक भ्रूण बनते हैं लेकिन वे अंकुरित होने में विफल रहते हैं; कम से कम कुछ दैहिक भ्रूण अधिकांश मामलों में अंकुरित नहीं होते हैं।

जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, ये भ्रूण सीधे एक्सप्लांट पर या अप्रत्यक्ष रूप से कैलस के माध्यम से हो सकते हैं। एक्सप्लांट या कैलस से पुनर्जीवित होने वाले दैहिक भ्रूणों को प्राथमिक दैहिक भ्रूण (primary somatic embryos) कहा जाता है। कई मामलों में, दैहिक भ्रूण अन्य दैहिक भ्रूण के ऊतकों या अंकुरित दैहिक भ्रूण के भागों से पुनर्जीवित होते हैं। ऐसे दैहिक भ्रूणों को द्वितीयक दैहिक भ्रूण (secondary somatic embryos) कहा जाता है (और इस प्रक्रिया को द्वितीयक भ्रूणजनन (secondary embryogenesis) या आवर्ती भ्रूणजनन (recurrent embryogenesis) कहा जाता है)।

दैहिक भ्रूणजनन को प्रभावित करने वाले कारक (Factors affecting somatic embryogenesis)

1. वृद्धि नियामक (Growth regulators): अधिकांश प्रजातियों में, दैहिक भ्रूणजनन के लिए एक ऑक्सिन आवश्यक है। ऑक्सिन एक्सप्लांट के निर्विभेदीकरण (dedifferentiation) का कारण बनता है जो विभाजित होना शुरू कर देता है। गाजर में, छोटी सघन कोशिकाएं सममित रूप से विभाजित होती हैं और उनकी बेटी कोशिकाएं एक साथ चिपक कर कोशिका द्रव्यमान बनाती हैं जिन्हें प्रोएम्ब्रायोजेनिक द्रव्यमान (proembryogenic masses) या भ्रूणजनित गुच्छे (embryogenic clumps) या 'प्रोएम्ब्रायोजेनिकली निर्धारित कोशिकाएं (PEDC)' कहा जाता है। ऑक्सिन की उपस्थिति में, भ्रूणजनित गुच्छे बढ़ते हैं और छोटे कोशिका द्रव्यमान में टूट जाते हैं जो फिर से भ्रूणजनित गुच्छे पैदा करते हैं। लेकिन जब ऑक्सिन को हटा दिया जाता है या कम कर दिया जाता है और कोशिका घनत्व कम हो जाता है, तो प्रत्येक भ्रूणजनित गुच्छा कुछ से कई दैहिक भ्रूणों को जन्म देता है। टोटीपोटेंट (totipotent) कोशिकाओं द्वारा उत्पादित कुछ ग्लाइकोप्रोटीन (glycoproteins) माध्यम में स्रावित होते हैं; जब इन प्रोटीनों को कल्चर माध्यम में जोड़ा जाता है तो वे टोटीपोटेंसी प्राप्त करने की प्रक्रिया को तेज कर देते हैं। प्रोटीन का एक वर्ग, जिसे अरेबिनोगैलेक्टन प्रोटीन (arabinogalactan proteins) (प्रोटीन रीढ़ के साथ 90% कार्बोहाइड्रेट) कहा जाता है, अविभेदित गाजर कोशिकाओं में दैहिक भ्रूण पुनर्जनन को प्रेरित करता है, जो इस प्रक्रिया में उनकी भूमिका को दर्शाता है। ऑक्सिन DNA के हाइपरमेथाइलेशन (hypermethylation) को बढ़ावा देते हैं जो टोटीपोटेंसी अधिग्रहण में भूमिका निभा सकता है। अल्फाल्फा (alfalfa) में, दैहिक भ्रूणजनन के आवर्ती चक्र (recurrent cycles) - द्वितीयक भ्रूणजनन या आवर्ती भ्रूणजनन - वृद्धि नियामक मुक्त माध्यम में होते हैं और प्रत्येक दैहिक भ्रूण लगभग 30 दैहिक भ्रूणों को जन्म दे सकता है।
2. सुक्रोज (Sucrose): जब भ्रूणजनित गुच्छों को एक उपयुक्त माध्यम में स्थानांतरित किया जाता है, तो दैहिक भ्रूण गोलाकार, हृदय के आकार, टारपीडो से बीजपत्र चरणों में आगे बढ़ता है। इसे दैहिक भ्रूण विकास चरण (somatic embryo development phase) कहा जाता है। अधिकांश प्रजातियों में, दैहिक भ्रूण बीजपत्र चरण के तुरंत बाद अंकुरित होना शुरू कर देते हैं, और इसे दैहिक भ्रूण रूपांतरण (somatic embryo conversion) कहा जाता है। लेकिन पौधे बहुत कमजोर होंगे। इसलिए, दैहिक भ्रूणों को परिपक्वता चरण (maturation phase) के अधीन किया जाता है। इस चरण में, दैहिक भ्रूण बढ़ते नहीं हैं बल्कि अधिक मजबूत और कठोर होने के लिए जैव रासायनिक परिवर्तनों (biochemical changes) से गुजरते हैं। यह उन्हें उच्च सुक्रोज माध्यम पर या ABA की उपयुक्त सांद्रता की उपस्थिति में संवर्धित करके या उन्हें डेसिकेशन (desiccation) (सूखने) के अधीन करके प्राप्त किया जाता है (आमतौर पर यह एक बाँझ, सीलबंद, खाली पेट्री डिश (Petri dishes) में दैहिक भ्रूणों को संलग्न करके प्राप्त किया जाता है)। यह दैहिक भ्रूण रूपांतरण को कई गुना सुधारता है।
3. नाइट्रोजन स्रोत (Nitrogen source): नाइट्रोजन के रूप का दैहिक भ्रूणजनन पर स्पष्ट प्रभाव पड़ता है। गाजर में, दैहिक भ्रूण प्रेरण के दौरान \(NH_4^+\) आवश्यक है, जबकि दैहिक भ्रूण विकास एकमात्र नाइट्रोजन स्रोत के रूप में \(NO_3^-\) युक्त माध्यम पर होता है। अल्फाल्फा दैहिक भ्रूण की उपज में काफी वृद्धि हुई है जब प्रोलाइन (proline), एलानिन (alanine), आर्गिनिन (arginine) और ग्लूटामाइन (glutamine) जैसे अमीनो एसिड (amino acids) को माध्यम में जोड़ा गया था।
4. एक्सप्लांट का जीनोटाइप (Genotype of explant): एक्सप्लांट जीनोटाइप दैहिक भ्रूण के पुनर्जनन को निर्धारित कर सकता है। जांच की गई चावल की 500 किस्मों में से, 19 में 65-100% भ्रूणजनन, 41 में 35-64% भ्रूणजनन दिखाया गया और शेष 440 किस्में पुनर्जनन में कम कुशल थीं। ये जीनोटाइपिक भिन्नताएं हार्मोन के अंतर्जात (endogenous) स्तरों के कारण हो सकती हैं। गेहूं में, पुनर्जनन को प्रभावित करने वाले प्रमुख और नियामक जीन 2A, 2B और 2D पर मैप किए गए थे। मक्का, चावल और गेहूं में पुनर्जनन क्षमता के लिए भिन्नता अत्यधिक योगात्मक (additive) और आनुवंशिक (heritable) है। लेकिन जौ (barley) और अल्फाल्फा में, प्रभुत्व (dominance) अधिक महत्वपूर्ण लगता है। माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम (Mitochondrial genome) का भी पुनर्जनन (उदा. गेहूं) पर प्रभाव पड़ा है। यह दिखाया गया है कि गैर-भ्रूणजननिक कोशिकाओं में 8 kb माइटोकॉन्ड्रियल DNA खंड के नुकसान ने अविभेदित कोशिकाओं को पुनर्जीवित करने की क्षमता में विशेष भूमिका निभाई। कई रिकैल्सिट्रेंट (recalcitrant) प्रजातियों (अनाज, अनाज फलियां और वन वृक्ष प्रजातियां) के पुनर्जनन संवर्धनों को प्राप्त करने में सफलता काफी हद तक मीडिया संशोधन के बजाय एक्सप्लांट चयन के कारण संभव हुई है। रिकैल्सिट्रेंट पौधों के भ्रूणजननिक संवर्धनों को बढ़ाने के लिए अपरिपक्व जाइगोटिक भ्रूण (immature zygotic embryos) सबसे अच्छे एक्सप्लांट साबित हुए हैं। हालांकि, सोयाबीन के दैहिक भ्रूणों के बीजपत्रों ने जाइगोटिक भ्रूणों की तुलना में काफी अधिक भ्रूणजननिक प्रतिक्रिया दी।

अन्य कारक: पॉलीमाइन (Polyamines) (प्यूट्रेसिन (putrescine), स्पर्मिडाइन (spermidine) और स्पर्मिन (spermine)) विवो या इन विट्रो में भ्रूण के विकास के लिए आवश्यक हैं। उच्च \(K^+\) स्तर और निम्न घुलित \(O_2\) स्तर कुछ प्रजातियों में दैहिक भ्रूण पुनर्जनन को बढ़ावा देते हैं। घुलनशील ऑक्सीजन की कमी की आवश्यकता को माध्यम में ATP को जोड़कर प्रतिस्थापित किया जा सकता है, जो यह दर्शाता है कि, संभवतः, ऑक्सीजन तनाव (oxygen tension) ने सेलुलर ATP के स्तर को बढ़ाया। साइट्रस (Citrus) में, इथेनॉल (ethanol) जैसे कुछ वाष्पशील यौगिक (volatile compounds) दैहिक भ्रूण पुनर्जनन को रोकते हैं।

विविध कारक (Miscellaneous factors):

• a) संवर्धन पर्यावरण (Culture environment)
• b) ऊतक संवर्धन प्रक्रिया के दौरान जीवाणु यौगिक (Bacterial compounds) या संदूषण (contamination)।
• c) विद्युत उत्तेजना (Electric stimulation): गेहूं, तंबाकू और अल्फाल्फा कैलस संवर्धन में प्ररोह कली विभेदीकरण की उत्तेजना हल्के विद्युत क्षेत्र (0.02 V) के संपर्क से प्राप्त की गई थी।

दैहिक भ्रूणों का बड़े पैमाने पर उत्पादन (Large scale production of somatic embryos):

चूंकि भ्रूणजननिक कोशिकाओं का गुणन और दैहिक भ्रूणों का बाद का विकास तरल माध्यम में हो सकता है, दैहिक भ्रूणजनन स्वचालित बायोरिएक्टर (automated bioreactors) में बड़े पैमाने पर पौधों के प्रसार के लिए कम श्रम इनपुट के साथ एक संभावित प्रणाली प्रदान करता है। बायोरिएक्टर में दैहिक भ्रूणों के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए, कैलस एक अर्ध-ठोस माध्यम (semi-solid medium) पर शुरू किया जाता है। अविभेदित या भ्रूणजननिक कैलस के टुकड़ों को छोटे फ्लास्क में तरल माध्यम में स्थानांतरित किया जाता है और शेकर में हिलाया जाता है। फ्लास्क में गुणन के कुछ चक्रों (cycles) के बाद, भ्रूणजननिक निलंबन (embryogenic suspension) को उपयुक्त छिद्र आकार की छलनी (sieve) के माध्यम से फ़िल्टर किया जा सकता है और प्रोएम्ब्रायोजेनिक द्रव्यमान (PEM) या गोलाकार भ्रूण को बायोरिएक्टर फ्लास्क में स्थानांतरित किया जा सकता है। चूंकि दैहिक भ्रूण व्यक्तिगत रूप से प्रपोग्यूल्स (propogules) हैं, इसलिए 10-100 X 10³ भ्रूणों की उत्पादन क्षमता वाला 2-5 लीटर बायोरिएक्टर वाणिज्यिक सूक्ष्म प्रवर्धन के लिए पर्याप्त होना चाहिए।

प्ररोह कलियों (shoot buds) और दैहिक भ्रूणों के बीच अंतर

अंगजनन के दौरान घटनाएँ (Events during organogenesis)

यह एक सामान्य नियम है कि अंग निर्माण पैरेन्काइमा (parenchyma) के अविभेदित द्रव्यमान में विभेदीकरण की प्रक्रिया के माध्यम से होगा। अधिकांश पैरेन्काइमेटस कोशिकाएं अत्यधिक रिक्तिका (vacuolated) वाली होती हैं और अस्पष्ट नाभिक (inconspicuous nuclei) और साइटोप्लाज्म के साथ होती हैं, कभी-कभी लिग्निफिकेशन (lignification) के साथ। कोशिकाओं के इस समूह में, यादृच्छिक कोशिका विभाजन (random cell division) दिखाने वाले क्षेत्र होंगे, जिससे विभेदित ऊतकों की रेडियल फ़ाइलें (radial files) बनेंगी। ये बिखरे हुए कोशिका विभाजन क्षेत्र उच्च समसूत्री गतिविधि (mitotic activity) के क्षेत्र बनाएंगे जिसके परिणामस्वरूप मेरिस्टेमेटिक केंद्रों (meristematic centres) का निर्माण होगा, जिन्हें अन्यथा मेरिस्टेमॉइड कहा जाता है। ये मेरिस्टेमॉइड या तो कैली की सतह पर हो सकते हैं या ऊतक में अंतर्निहित (embedded) हो सकते हैं। इन मेरिस्टेमॉइड्स में निरंतर कोशिका विभाजन कैली की सतह पर छोटे उभार (protruberences) पैदा करेगा, जिससे ऊतकों को गांठदार रूप (nodular appearance) मिलेगा। मेरिस्टेमॉइड्स से, अंगों के आद्यक बार-बार समसूत्री गतिविधि द्वारा प्ररोह या जड़ बनाते हैं। इसकी खोज टॉरे (Torrey) ने 1966 में की थी।

मेरिस्टेमॉइड्स में घने साइटोप्लाज्म और उच्च न्यूक्लियो-साइटोप्लाज्मिक अनुपात (nucleo-cytoplasmic ratio) वाले छोटे आइसोडायमेट्रिक (isodiametric) मेरिस्टेमेटिक कोशिकाओं का एक गोलाकार द्रव्यमान (spherical mass) होता है। आम तौर पर, कैलस ऊतक अंगजनन से पहले स्टार्च (starch) और अन्य क्रिस्टल जमा करते हैं, लेकिन मेरिस्टेमॉइड निर्माण के दौरान पदार्थ गायब हो जाते हैं। मेरिस्टेमॉइड निर्माण के प्रारंभिक चरणों के दौरान, साइटोप्लाज्मिक उभार (protrusions) रिक्तिकाओं (vacuoles) में प्रवेश करते हैं जिससे रिक्तिकाएं प्रत्येक कोशिका की परिधि (periphery) के आसपास वितरित हो जाती हैं या पूरे साइटोप्लाज्म में फैल जाती हैं। केंद्रक अधिकतम संभव आकार के साथ केंद्र में है। इस प्रकार मेरिस्टेमॉइड्स में कोशिकाएं एक अक्षुण्ण पौधे (intact plant) में अत्यधिक सक्रिय मेरिस्टेम की कोशिकाओं के समान होती हैं।

भ्रूणजनन

भ्रूण को विकास के प्रारंभिक चरण में एक पौधे के रूप में परिभाषित किया गया है। प्रत्येक भ्रूण में दो अलग-अलग ध्रुव होते हैं, एक जड़ बनाने के लिए और दूसरा प्ररोह, और यह युग्मकों (gametes) के संलयन (fusion) का उत्पाद है। कुछ पौधों की प्रजातियों में, युग्मकों के संलयन के बिना भ्रूण का उत्पादन होता है और इसे अलैंगिक भ्रूणजनन (asexual embryogenesis) या अपस्थानिक भ्रूणी (adventitious embyrony) कहा जाता है।

एक अक्षुण्ण पौधे में इस प्रकार का भ्रूणजनन बीजांडावरण (integuments) और न्यूसेलर ऊतकों (nucellar tissues) जैसे स्पोरोफाइटिक (sporophytic) ऊतकों में या अनिषेचित (unfertilized) गैमेटिक कोशिकाओं से हो सकता है। भ्रूण निर्माण के सामान्य पाठ्यक्रम अर्थात जाइगोटिक भ्रूणजनन और अपस्थानिक भ्रूणी के अलावा, इन विट्रो में ऊतक संवर्धन से भ्रूण निर्माण के उदाहरण सामने आए हैं। दैहिक भ्रूणजनन नामक इस घटना को सबसे पहले स्टीवर्ड (Steward) और उनके सहकर्मियों (1958) ने गाजर के निलंबन संवर्धन में देखा था, जिसके बाद रीनर्ट (Reinert, 1959) ने इसे देखा। तब से, भ्रूण निर्माण की कई रिपोर्टें प्रकाशित हुई हैं।

दैहिक भ्रूणजनन या इन विट्रो में भ्रूणजनन संरचना और आकारिकी क्षमता (morphogenetic potential) में जाइगोटिक भ्रूणों के समान भ्रूण जैसी संरचनाएं उत्पन्न करता है। इस समानता के बावजूद, दैहिक कोशिका (somatic cell) से भ्रूण जैसी संरचना का व्युत्पत्ति (ontogeny) जाइगोटिक भ्रूण से अलग है, जहां उत्पत्ति एक एकल कोशिका से होती है।

भ्रूणाभ (Embryoid) का उपयोग आम तौर पर संवर्धित ऊतकों से भ्रूण जैसी संरचना को दर्शाने के लिए किया जाता है। इन भ्रूणाभ में द्विध्रुवीयता (bipolarity) होती है, मातृ ऊतक के साथ कोई संवहनी संबंध (vascular connection) नहीं होता है और एक एकल कोशिका या कोशिकाओं के समूह से उत्पत्ति होती है।

भ्रूणजनन के दौरान घटनाएँ (Events during embryogenesis)

1959 में, रीनर्ट (Reinert) ने यह उल्लेखनीय दावा किया कि पोषक तत्व मीडिया (nutrient media) में परिवर्तन के बाद, जड़ व्युत्पन्न कैलस ऊतक (root derived callus tissue) Daucas carota ने सामान्य द्विध्रुवीय भ्रूण (bipolar embryos) उत्पन्न किए। पोषक माध्यम में किए गए या देखे गए परिवर्तन इस प्रकार थे: ऑक्सिन (IAA पर 10 mg/litre) के उच्च स्तर के साथ व्हाइट (White's) माध्यम में कैलस का रखरखाव और विटामिन, अमीनो एसिड, एमाइड्स (amides) और प्यूरीन (purines) जैसे योजक (additives) के साथ व्हाइट के बेसल माध्यम पर कई महीनों तक कैलस का उप-संवर्धन। इन संशोधन के परिणामस्वरूप, कैली ने सतह पर छोटे उभार दिखाए। इन कैली के हिस्टोलॉजिकल अनुभागों (Histological sections) ने संगठित विकास के केंद्रों को दिखाया। संगठित केंद्रों वाले इन ऊतकों को ऑक्सिन की कमी वाले लेकिन नारियल के दूध (coconut milk) वाले माध्यम में स्थानांतरित करने पर भ्रूणाभ का उत्पादन हुआ और भ्रूणाभ से, पूरे पौधे बने।

भ्रूणजनन पर सिद्धांत (Theories on embryogenesis):

दैहिक भ्रूणजनन की घटना को समझाने के लिए कई सिद्धांत प्रस्तावित किए गए हैं, जिनमें से निम्नलिखित को महत्वपूर्ण माना जाता है:

1. कोशिका अलगाव सिद्धांत (Cell isolation theory): स्टीवर्ड और उनके सहकर्मियों ने 1964 में इस सिद्धांत का प्रस्ताव रखा था। उनके अनुसार, भ्रूण उत्पन्न करने वाली कोशिकाएं कोशिका द्रव्यमान (cell mass) में पड़ोसी कोशिकाओं से अलग हो जाती हैं। कोशिकाओं का अलगाव भ्रूणजनन का पक्षधर है। कोशिकाओं का अलगाव कोशिकाओं के भौतिक और शारीरिक अलगाव के कारण आसपास की कोशिकाओं में बाधाओं (constraints) से प्रेरित हो सकता है। अधिकांश मामलों में, प्लाज्मोडेस्माटा (plasmodesmata) का संबंध टूट गया था। लेकिन यह आम तौर पर प्रेरण प्रक्रिया (induction process) के लिए द्वितीयक (secondary) प्रतीत होता है।
2. विभेदीकरण सिद्धांत (Differentiation theory): यह सिद्धांत बताता है कि भ्रूण एक्सप्लांट्स की विभेदित (differentiated) कोशिकाओं से उत्पन्न नहीं होंगे। कैलस बनाने के लिए एक्सप्लांट्स की कोशिकाओं को निर्विभेदीकरण से गुजरना पड़ता है। फिर कैलस की कोशिकाएं भ्रूण का उत्पादन करेंगी। दूसरे शब्दों में, इन विट्रो में दैहिक भ्रूणों के उत्पादन के लिए कोशिकाओं में निर्विभेदीकरण एक शर्त (prerequisite) है। यह कि भ्रूण सीधे तने या हाइपोकोटाइल (hypocotyl) की एपिडर्मल कोशिकाओं (epidermal cells) से बन सकते हैं, बिना निर्विभेदीकरण के भ्रूण निर्माण की संभावना का संकेत देते हैं। विभेदीकरण की आवश्यकता प्राथमिक संवर्धन (primary culture) के दौरान उपयोग की जाने वाली एक्सप्लांट सामग्री पर निर्भर करती है। तने, हाइपोकोटाइल और युवा भ्रूणों की एपिडर्मल कोशिकाएं बिना कैलस चरण से गुजरे भ्रूण विकास शुरू कर सकती हैं, जबकि कॉर्टिकल कोशिकाओं (cortical cells) और जाइलम (xylem) और फ्लोएम (phloem) एक्सप्लांट्स की कोशिकाओं को निर्विभेदीकरण की आवश्यकता होती है। यह सिद्धांत 1970 में हैल्परिन (Halperin) द्वारा प्रस्तावित किया गया था।
3. अंतरकोशिकीय संचार और कोशिका-विभेदीकरण सिद्धांत (Intercellular communication and cytodifferentiation theory): इस सिद्धांत के अनुसार, अंतरकोशिकीय संचार (intercellular communication) के कारण कोशिकाओं में कोशिका-विभेदीकरण (cytodifferentiation) भ्रूण निर्माण को प्रेरित करता है। कोशिका-विभेदीकरण पोषक तत्वों, अंतर्जात पादप वृद्धि नियामकों और गैसीय कारकों (gaseous factors) जैसे \(O_2\), \(CO_2\) और एथिलीन (ethylene) के प्रसार प्रवणताओं (diffusion gradients) द्वारा नियंत्रित होता है। संवर्धन के वातावरण में बदलती सूक्ष्म जलवायु (microclimate) अंतरकोशिकीय संचार और बदले में कोशिका-विभेदीकरण को प्रभावित करती है। यह अवधारणा स्ट्रीट (Street, 1973) द्वारा प्रस्तावित की गई थी।
4. एक्सप्लांट शरीर क्रिया विज्ञान और संवर्धन पर्यावरण सिद्धांत (Explant physiology and culture environment theory): यह अवधारणा 1976 में स्ट्रीट (Street) द्वारा विकसित की गई थी। उनका विचार है कि भ्रूणजनन एक्सप्लांट और संवर्धन पर्यावरण पर निर्भर घटना है। फूलों की कलियों (flower buds), युवा भ्रूणों और युवा अंकुर (seedling) के हिस्सों जैसे एक्सप्लांट्स दैहिक भ्रूण उत्पन्न करने के लिए सबसे अधिक उत्तरदायी होते हैं, लेकिन परिपक्व (mature) पौधों से नहीं। एक्सप्लांट फिजियोलॉजी के अलावा, संवर्धन का वातावरण भी भ्रूणजनन को प्रभावित करने वाला एक कारक है। उदाहरण के लिए, अत्यधिक भ्रूणजननिक कैलस संवर्धन को गैर-भ्रूणजननिक (non-embryogenic) बनाए रखा जा सकता है यदि माध्यम में उच्च स्तर का ऑक्सिन पूरक (supplemented) हो और उसी को ऑक्सिन मुक्त माध्यम में स्थानांतरित करने पर भ्रूण उत्पन्न करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है।
5. पूर्व-निर्धारण सिद्धांत (Pre-determination theory): यह टिसेराट एट अल. (Tisserat et al., 1979) द्वारा प्रस्तावित किया गया था। इसमें कहा गया है कि भ्रूण उत्पादन क्षमता कोशिकाओं में पूर्व-निर्धारित (pre-determined) घटना है और इन-विट्रो संवर्धन भ्रूणजनन के लिए अवसर प्रदान करती है। दूसरे शब्दों में, एक कोशिका से भ्रूणजनन एक अंतर्निहित (inherent) है जिसे इष्टतम (optimal) संवर्धन पर्यावरण द्वारा भ्रूण उत्पन्न करने के लिए सुगम बनाया जाता है।
6. पूर्व और प्रेरित भ्रूणजननिक निर्धारित कोशिका सिद्धांत (Pre and induced embryogenic determined cell theory): यद्यपि भ्रूणजनन पूर्व-निर्धारित है, एक्सप्लांट्स से सीधे भ्रूणों के गैर-गठन (non-formation) के उदाहरण हैं। इन मामलों में, प्राथमिक एक्सप्लांट और भ्रूण के बीच एक मध्यवर्ती कैलस चरण आता है। कैली में कोशिकाओं को प्रासंगिक वृद्धि नियामक (relevant growth regulator) के साथ माध्यम के संशोधन द्वारा भ्रूण उत्पन्न करने के लिए प्रेरित किया जाता है। इसके आधार पर, उपरोक्त सिद्धांत शार्प (Sharp) और उनके सहकर्मियों द्वारा प्रस्तावित किया गया था। इस सिद्धांत के अनुसार, भ्रूणजननिक कोशिकाएं दो प्रकार की होती हैं: पूर्व-भ्रूणजननिक निर्धारित कोशिकाएं (pre-embryogenic determinded cells - PEDC) और प्रेरित भ्रूणजननिक निर्धारित कोशिकाएं (induced embryogenic determined cells - IEDC)।

पूर्व-भ्रूणजननिक निर्धारित भ्रूणजननिक कोशिकाओं में, भ्रूणजनन (embryogeny) माइटोसिस (mitosis) से पहले निर्धारित होता है, जबकि प्रेरित भ्रूणजननिक निर्धारित कोशिकाओं में, उपयुक्त माइटोजेनिक पदार्थ (mitogenic substance) प्रदान करके भ्रूणजनन प्रेरित होता है, अर्थात कैलस की कोशिकाओं में पौधे वृद्धि नियामकों के उपयोग से भ्रूणजनन प्रेरित होता है। इस प्रकार कैलस में, भ्रूणजननिक पूर्ववर्ती कोशिकाएं (embryogenic precursor cells) या भ्रूणजननिक मातृ कोशिकाएं (embryogenic mother cells) बनती हैं जो फिर भ्रूणजननिक कोशिकाओं में विकसित होती हैं। बाद में ये कोशिकाएं गोलाकार, हृदय (heart) और टारपीडो के आकार के भ्रूण बनाकर सामान्य भ्रूणजनन के विशिष्ट ध्रुवीकृत कोशिका विभाजन (polarised cell divisions) से गुजरती हैं。

भ्रूणजनन के प्रतिरूप (Patterns of embryogenesis)

इन विट्रो में भ्रूणजनन के दो सामान्य प्रतिरूप पहचाने जाते हैं: इन विट्रो में संवर्धित ऊतक से सीधे भ्रूण की उत्पत्ति (प्रत्यक्ष भ्रूणजनन - direct embryogenesis) और कैलस चरण के माध्यम से भ्रूण की उत्पत्ति (अप्रत्यक्ष भ्रूणजनन - indirect embryogenesis)।

तालिका. प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष भ्रूणजनन के बीच अंतर (Differences between direct and indirect embryogenesis)

प्रश्न (Questions)

1. वह प्रक्रिया जिसके द्वारा विभज्योतकी कोशिकाएं दो या अधिक प्रकार की कोशिकाओं, ऊतकों या अंगों में परिवर्तित हो जाती हैं जो गुणात्मक रूप से एक-दूसरे से भिन्न होते हैं, वह है ………
   a). विभेदीकरण
   b). निर्विभेदीकरण
   c). पुनर्विभेदीकरण
   d). पुनर्जनन
2. इस शब्द का उपयोग अत्यधिक संगठित ऊतकों से असंगठित ऊतकों के निर्माण की प्रक्रिया को दर्शाने के लिए किया जाता है ………
   a). विभेदीकरण
   b). निर्विभेदीकरण
   c). पुनर्विभेदीकरण
   d). पुनर्जनन
3. एक अविभेदित ऊतक में होने वाली विभेदीकरण की प्रक्रिया
   a). विभेदीकरण
   b). निर्विभेदीकरण
   c). पुनर्विभेदीकरण
   d). पुनर्जनन
4. संवर्धित एक्सप्लांट्स से सीधे या कैलस के माध्यम से अप्रत्यक्ष रूप से एक पूरे पौधे की उत्पत्ति को पुनर्जनन कहा जाता है
   a). विभेदीकरण
   b). निर्विभेदीकरण
   c). पुनर्विभेदीकरण
   d). पुनर्जनन
5. जैविक संगठन या रूप प्राप्त करने को ……… कहा जाता है।
   a). विभेदीकरण
   b). निर्विभेदीकरण
   c). पुनर्विभेदीकरण
   d). आकारजनन
6. आकारजनन किसके द्वारा प्राप्त किया जा सकता है ………
   a). अंगों की नए सिरे से उत्पत्ति (de novo origin of organs)
   b). भ्रूणों की नए सिरे से उत्पत्ति (de novo origin of embryos)
   c). a और b दोनों
   d). उपरोक्त में से कोई नहीं
7. इन विट्रो में प्ररोह अंगजनन (shoot organogenesis) के प्रेरण पर पहली रिपोर्ट ……… थी
   a). व्हाइट (White)
   b). नोबेकोर्ट (Nobecourt)
   c). स्कूग (Skoog)
   d). मिलर (Miller)
8. इन विट्रो में जड़ अंगजनन (root organogenesis) के प्रेरण पर पहली रिपोर्ट ……… थी
   a). व्हाइट
   b). नोबेकोर्ट
   c). स्कूग
   d). मिलर
9. इन विट्रो में प्ररोह अंगजनन का प्रेरण मुख्य रूप से ……… में प्राप्त किया गया था
   a). तंबाकू (tobacco)
   b). गाजर
   c). a और b दोनों
   d). उपरोक्त में से कोई नहीं
10. इन विट्रो में जड़ अंगजनन का प्रेरण मुख्य रूप से ……… में प्राप्त किया गया था
    a). तंबाकू
    b). गाजर
    c). a और b উভয়
    d). उपरोक्त में से कोई नहीं
11. एक विकासात्मक अनुक्रम (developmental sequence) जिसमें एक मध्यवर्ती कैलस चरण शामिल होता है, उसे कहा जाता है
    a). 'अप्रत्यक्ष' अंगजनन
    b). 'प्रत्यक्ष' अंगजनन
    c). आकारजनन
    d). उपरोक्त में से कोई नहीं
12. अंगजनन के दौरान विकसित असामान्य संरचनाओं को कहा जाता है ……
    a). ऑर्गेनोइड्स
    b). मेरिस्टेमॉइड्स
    c). a और b दोनों
    d). उपरोक्त में से कोई नहीं
13. कैलस पर स्थानीयकृत विभज्योतकी कोशिकाएं जो प्ररोह और/या जड़ों को जन्म देती हैं, उन्हें ……… कहा जाता है।
    a). ऑर्गेनोइड्स
    b). मेरिस्टेमॉइड्स
    c). a और b दोनों
    d). उपरोक्त में से कोई नहीं
14. बीज संवर्धन का उपयोग …… के लिए किया जाता है।
    a). बीजों के अंकुरण की दक्षता बढ़ाने के लिए
    b). PGR के अनुप्रयोग द्वारा अकाल अंकुरण
    c). एक्सप्लांट्स या मेरिस्टेम संवर्धन के लिए स्वच्छ पौधों का उत्पादन
    d). उपरोक्त सभी
15. भ्रूण संवर्धन का उपयोग …… के लिए किया जाता है।
    a). असंगति बाधाओं के कारण भ्रूण के गर्भपात को दूर करने के लिए
    b). बीज की प्रसुप्ति और बीजों के स्व-बांझपन को दूर करने के लिए
    c). दूरस्थ संकरण (distant hybridisation) में भ्रूण बचाव
    d). उपरोक्त सभी
16. अंडाशय या बीजांड संवर्धन का उपयोग …… के लिए किया जाता है।
    a). दैहिक भ्रूणजनक संवर्धनों की शुरुआत
    b). अगुणित पौधों का उत्पादन
    c). व्यापक संकरों के भ्रूणों के गर्भपात को दूर करने के लिए
    d). उपरोक्त सभी