अगुणित उत्पादन और उपयोग (Haploid production and uses)

अगुणित (Haploids) को ऐसे स्पोरोफाइट (Sporophytes) के रूप में परिभाषित किया जाता है जिनमें युग्मकोद्भिद (Gametophytic) गुणसूत्र संख्या (chromosome number) होती है। इन्हें विभिन्न विधियों का उपयोग करके कई पौधों की प्रजातियों में उत्पादित किया गया है।

हालाँकि, आनुवंशिकी (Genetics) और पादप प्रजनन (Plant breeding) में अगुणित के महत्व को लंबे समय से मान्यता प्राप्त है, लेकिन जैव प्रौद्योगिकी (Biotechnology) के आगमन के साथ इसे नया महत्व मिला है, जिससे विभिन्न देशों में जैव प्रौद्योगिकी कार्यक्रमों में अगुणित का उत्पादन एक महत्वपूर्ण हिस्सा बन गया है।

हालाँकि अगुणित का उत्पादन विलंबित परागण (Delayed pollination), पराग (Pollen) के विकिरण (Irradiation), तापमान के झटके (Temperature shocks), कोल्चिसिन उपचार (Colchicine treatment) और दूरस्थ संकरण (Distant hybridization) द्वारा किया जा सकता है, लेकिन वर्तमान में उपयोग की जाने वाली सबसे महत्वपूर्ण विधियों में शामिल हैं:

• परागकोश या पराग संवर्धन और बीजांड संवर्धन (Anther or pollen culture and ovule culture)
• अंतर-विशिष्ट संकरण (Interspecific hybridization) के बाद गुणसूत्र विलोपन (Chromosome elimination) - बल्बोसम तकनीक (Bulbosum technique)।

परागकोश और सूक्ष्मबीजाणु संवर्धन (Anther and microspore culture)

आनुवंशिकी और पादप प्रजनन में अगुणित उत्पादन के प्रभाव को लंबे समय से महसूस किया गया है। हालाँकि, उनका उपयोग सीमित रहा क्योंकि प्रकृति में उनकी घटना की आवृत्ति बहुत कम है। अगुणितों का स्वतः उत्पादन आमतौर पर अनिषेकजनन (Parthenogenesis) (अनिषेचित अंडे से भ्रूण का विकास) की प्रक्रिया के माध्यम से होता है। शायद ही कभी, वे केवल नर जनक को पुनः उत्पन्न करते हैं। यह बताता है कि उनकी उत्पत्ति 'बीजांड पुंजनन (Ovule androgenesis)' (केवल नर केंद्रक की गतिविधि द्वारा बीजांड के अंदर भ्रूण का विकास) के माध्यम से होती है। इन विवो (In vivo) एण्ड्रोजेनिक (Androgenic) अगुणितों की घटना Antirrhinum, Nicotiana आदि में दर्ज की गई है। अगुणितों के कृत्रिम उत्पादन का प्रयास दूरस्थ संकरण, विलंबित परागण, विकिरणित पराग के अनुप्रयोग, हार्मोन उपचार और तापमान के झटके के माध्यम से किया गया था। हालाँकि, इनमें से कोई भी विधि विश्वसनीय नहीं है।

Datura innoxia के परागकोश संवर्धन में कई पराग पौधों (Pollen plantlets) का विकास, जिसे सबसे पहले दो भारतीय वैज्ञानिकों (गुहा और माहेश्वरी) द्वारा रिपोर्ट किया गया था, उच्च पौधों के अगुणित प्रजनन में एक बड़ी सफलता थी। परागकोश संवर्धन (परागकोश पुंजनन या anther androgenesis या केवल पुंजनन) के माध्यम से अगुणित उत्पादन की इस तकनीक को अनाज, सब्जियों, तेल और पेड़ों की प्रजातियों सहित कई पौधों की प्रजातियों तक विस्तारित किया गया है।

परागकोश (Anthers) खेत या गमलों में उगाए गए पौधों से लिए जा सकते हैं, लेकिन आदर्श रूप से इन पौधों को नियंत्रित तापमान, प्रकाश और आर्द्रता के तहत उगाया जाना चाहिए। अक्सर अगुणित उत्पादन की क्षमता दाता पौधों (Donor plants) की उम्र के साथ घट जाती है। उचित विकास अवस्था की फूलों की कलियों (Flower buds) को एकत्र किया जाता है, सतह को निष्फल (Surface sterilized) किया जाता है और उनके परागकोशों को काटकर संवर्धन माध्यम (Culture medium) पर क्षैतिज रूप से (Horizontally) रखा जाता है। परागकोशों को चोट से बचाने के लिए सावधानी बरतनी चाहिए क्योंकि यह परागकोश की दीवारों से कैलस (Callus) निर्माण को प्रेरित कर सकता है। वैकल्पिक रूप से, पराग कणों (Pollen grains) को परागकोशों से अलग किया जा सकता है और एक उपयुक्त माध्यम पर संवर्धित किया जा सकता है।

पराग का अलगाव (Isolation of pollen)

संवर्धित परागकोशों से पराग कणों को यांत्रिक रूप से निकाला जाता है। या तरल माध्यम पर संवर्धित ठंडे उपचार वाले परागकोश 2-7 दिनों के बाद फट जाते हैं, जिससे पराग कण माध्यम में मुक्त हो जाते हैं। इसे 'फ्लोट कल्चर विधि (Float culture method)' कहा जाता है जो ताजे या पूर्व-संवर्धित परागकोशों से पराग के यांत्रिक अलगाव की तुलना में बेहतर साबित हुई है。

अगुणितों के उत्पादन के लिए पृथक पराग संवर्धन की दक्षता में सुधार करने के लिए, वेंजेल (Wenzel) और उनके सहयोगियों ने घनत्व ढाल अपकेंद्रण (Density gradient centrifugation) की तकनीक पेश की। यह परागकोशों को कुचलने के बाद प्राप्त भ्रूणजन्य (Embryogenic) और गैर-भ्रूणजन्य (Non-embryogenic) कणों के मिश्रण से भ्रूणजन्य कणों को अलग करने की अनुमति देता है। विकास के उचित चरण में प्राप्त जौ (Barley) के परागकोशों को पराग कणों का निलंबन (Suspension) प्राप्त करने के लिए धीरे-धीरे कुचला (Macerated) जाता है। बार-बार निस्पंदन (Filtration) और अपकेंद्रण (Centrifugation) द्वारा मलबे को हटाने के बाद, निलंबन को 30% सुक्रोज (Sucrose) समाधान पर स्तरित किया गया और 5 मिनट के लिए 1200 g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। एण्ड्रोजेनिक, रिक्तिका युक्त (Vacuolated) पराग कणों ने सुक्रोज समाधान के शीर्ष पर एक बैंड बनाया। पृथक पराग संवर्धन न केवल अधिक कुशल है बल्कि परागकोश संवर्धन की तुलना में अधिक सुविधाजनक भी है। परागकोशों के विच्छेदन (Dissection) की थकाऊ प्रक्रिया से बचा जाता है। इसके बजाय, एक उपयुक्त आकार सीमा के भीतर पूरी कलियों को कुचल दिया जाता है और भ्रूणजन्य कणों को फिर ढाल अपकेंद्रण (Gradient centrifugation) द्वारा अलग किया जाता है।

विकास के मार्ग (Pathways of development)

प्रतिक्रिया देने वाले पराग कणों में प्रारंभिक विभाजन निम्नलिखित चार तरीकों में से एक में हो सकता है:

1. मार्ग I (Pathway I): एककेंद्रकीय (Uninucleate) पराग कण सममित (Symmetrically) रूप से विभाजित होकर दो समान संतति कोशिकाएं (Daughter cells) उत्पन्न कर सकता है, जिनमें से दोनों आगे विभाजित होती हैं। (Datura innotura)
2. मार्ग II (Pathway II): कुछ अन्य मामलों में (Nicotiana tabacum, Datura metel, Triticale), एककेंद्रकीय पराग असमान रूप से विभाजित होता है (जैसा कि यह प्रकृति में करता है)। जनन कोशिका (Generative cell) तुरंत या एक या दो विभाजन से गुजरने के बाद नष्ट (Degenerate) हो जाती है। कैलस/भ्रूण (Callus/embryo) वनस्पति कोशिकाओं (Vegetative cells) के क्रमिक विभाजनों के कारण उत्पन्न होता है।
3. मार्ग III (Pathway III): लेकिन कुछ प्रजातियों जैसे Hyoscyamus niger में, पराग भ्रूण (Pollen embryos) केवल जनन कोशिका से उत्पन्न होते हैं; वनस्पति कोशिका या तो विभाजित नहीं होती है या केवल एक सीमित सीमा तक विभाजित होकर निलंबक (Suspensor) जैसी संरचना बनाती है।
4. मार्ग IV (Pathway IV): कुछ प्रजातियों जैसे Datura innoxia में एककेंद्रकीय पराग कण असमान रूप से विभाजित होते हैं, जिससे जनन और वनस्पति कोशिकाएं पैदा होती हैं, लेकिन ये दोनों कोशिकाएं विकासशील भ्रूण/कैलस में योगदान करने के लिए बार-बार विभाजित होती हैं।

तंबाकू, गेहूं, जौ आदि जैसी कई फसल प्रजातियों के पराग कण पराग द्विरूपता (Pollen dimorphism) प्रदर्शित करते हैं। अधिकांश पराग कण बड़े होते हैं, एसिटोकारमाइन (Acetocarmine) के साथ गहरे रंग के होते हैं और इनमें प्रचुर मात्रा में स्टार्च (Starch) होता है। लेकिन पराग कणों का छोटा हिस्सा छोटा होता है और एसिटोकारमाइन के साथ हल्का रंग लेता है; इन्हें S-कण (S-grains) कहा जाता है। ये S-कण ही परागकोश संवर्धन के दौरान प्रतिक्रिया करते हैं। प्रतिक्रिया देने वाले पराग कणों की आवृत्ति को कुछ पूर्व-उपचारों (Pretreatments) जैसे कि ठंडा करने (Chilling) द्वारा S-कणों की तुलना में बढ़ाया जा सकता है। संवर्धित परागकोशों के पराग कण पहले 6-12 दिनों के दौरान उल्लेखनीय साइटोलॉजिकल (Cytological) परिवर्तन दिखाते हैं, जिसे प्रेरक अवधि (Inductive period) कहा जाता है। तंबाकू में, द्विकेंद्रकीय (Binucleate) पराग कणों का युग्मकोद्भिद कोशिकाद्रव्य (Gametophytic cytoplasm) विघटित हो जाता है, राइबोसोम (Ribosomes) समाप्त हो जाते हैं और केवल कुछ माइटोकॉन्ड्रिया (Mitochondria) और प्लास्टिड (Plastids) बचे रहते हैं। वनस्पति कोशिका के पहले बीजाणुउद्भिद (Sporophytic) विभाजन के बाद नए राइबोसोम संश्लेषित होते हैं।

प्रतिक्रियाशील पराग कण बहुकोशिकीय (Multicellular) हो जाते हैं और अंततः कोशिका द्रव्यमान (Cell mass) को मुक्त करने के लिए फट जाते हैं। यह कोशिका द्रव्यमान या तो एक गोलाकार भ्रूण (Globular embryo) का आकार ले सकता है और भ्रूणजनन (Embryogeny) के विकास के चरणों से गुजर सकता है या यह प्रजातियों के आधार पर कैलस में विकसित हो सकता है। पराग कैलस या पराग भ्रूण से पौधों का पुनर्जनन (Regeneration) मूल माध्यम (Original medium) पर हो सकता है या इसे एक अलग माध्यम में स्थानांतरित करने की आवश्यकता हो सकती है। पराग भ्रूण (Pollen embryo) अपनी आकृति विज्ञान (Morphology) और कुछ जैव रासायनिक (Biochemical) विशेषताओं में युग्मनजी भ्रूण (Zygotic embryos) के साथ काफी समानता प्रदर्शित करते हैं। अक्सर पराग भ्रूण सामान्य रूप से अंकुरित नहीं होते हैं। पराग भ्रूण अक्सर तने की सतह पर द्वितीयक भ्रूण (Secondary embryos) पैदा करते हैं और ऐसे सभी भ्रूण जो द्वितीयक भ्रूण पैदा करते हैं वे अगुणित (Haploid) होते हैं और अन्य गैर-अगुणित (Non-haploid) होते हैं। पराग भ्रूण से पूर्ण पौधे (Plantlets) उगाने के लिए, मूल भ्रूण (Parent embryo) के एक हिस्से के साथ द्वितीयक भ्रूणों के एक समूह को काटना और उन्हें ताजा माध्यम पर लगाना आवश्यक है। यदि उन्हें पराग भ्रूण पर छोड़ दिया जाए या व्यक्तिगत रूप से हटा दिया जाए तो वे अंकुरित नहीं होते हैं।

परागकोश संवर्धन और अगुणित पौधों का पुनर्जनन (Anther culture and haploid plants regeneration)

(a) संवर्धन की शुरुआत में परागकोश (Anther)। (b) 6 दिनों के संवर्धन के बाद परागकोश। (c, d) 30 दिनों के संवर्धन के बाद परागकोशों से निकलने वाले भ्रूण (Embryos), जड़ें (c) और प्ररोह (d) दिखाते हुए। (e–g) बीजपत्र (Cotyledons) के साथ पौधे (e) और बढ़ती हुई माध्यम में उप-संवर्धित पत्तियों (f, g) के साथ। (h) परागकोश संवर्धन से 80 दिन पुराना पुनर्जीवित अगुणित पौधा (बाईं ओर) और उसी उम्र का द्विगुणित (Diploid) नियंत्रण (दाईं ओर)। स्केल बार (a–d) में 2.5 मिमी; (e–h) में 5 मिमी।

पुंजनन (Androgenesis) को प्रभावित करने वाले कारक

• दाता पौधों की शारीरिक स्थिति (Physiological status of the donor plants): दाता पौधों की उम्र और पर्यावरणीय स्थितियां जिनके तहत उन्हें उगाया गया है, एण्ड्रोजेनिक प्रक्रिया को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करती हैं। आम तौर पर, फूलों के पहले प्रवाह से कलियां अलग-अलग पैदा होने वाली कलियों की तुलना में बेहतर प्रतिक्रिया दिखाती हैं। पोषक तत्वों और पानी के तनाव (Stresses) के संपर्क में आने से एण्ड्रोजेनेसिस को बढ़ावा मिलता है।
• पराग विकास का चरण (Stage of pollen development): पहले समसूत्री विभाजन (Mitosis) के आसपास पराग कण सबसे अधिक प्रतिक्रियाशील होते हैं। एककेंद्रकीय सूक्ष्मबीजाणु (Uninucleate microspores) अगुणित उत्पन्न करते हैं जबकि द्विकेंद्रकीय पराग उच्च प्लॉइडी (Ploidy) के पौधे बनाते हैं।
• परागकोश की दीवार के कारक (Anther wall factors): तंबाकू की एक किस्म (Cultivar) का पराग सफलतापूर्वक भ्रूण में विकसित हो जाएगा, भले ही इसे किसी अन्य किस्म के परागकोशों में स्थानांतरित कर दिया जाए।
• जीनोटाइप (Genotype): संकर (Hybrids) अपने माता-पिता की तुलना में अधिक एण्ड्रोजेनिक होते हैं।
• संवर्धित परागकोशों/पराग कणों का पूर्व-उपचार (Pretreatment of cultured anthers/pollen grains): मानक संवर्धन कक्ष की स्थितियों से पहले संवर्धित परागकोशों या पराग कणों के लिए कुछ भौतिक (तापमान का झटका, अपकेंद्रण, γ विकिरण) और रासायनिक (ऑक्सिन या auxins) उपचारों का अनुप्रयोग, इन विट्रो एण्ड्रोजेनेसिस (In vitro androgenesis) के लिए आवश्यक या प्रेरक साबित हुआ है।
• संवर्धन माध्यम: ईथरेल (2-क्लोरोएथिलफॉस्फोनिक एसिड), सुक्रोज, अगर (Agar) और कुछ जीनोटाइप के लिए विशिष्ट अन्य पोषक तत्वों के जुड़ने से एण्ड्रोजेनेसिस की सफलता दर में वृद्धि पाई गई।
• संवर्धन घनत्व (Culture density): यदि Brassica oleracea में परागकोश संवर्धन घनत्व को 3 परागकोश प्रति मिली से बढ़ाकर 12-24 परागकोश प्रति मिली कर दिया जाए, तो पराग भ्रूणजनन की आवृत्ति बढ़ गई।
• गैसीय वातावरण का प्रभाव (Effect of gaseous environment): परागकोशों के चारों ओर गैस मिश्रण की संरचना का परागकोश संवर्धन में उत्पादित भ्रूणों की संख्या पर गहरा प्रभाव पड़ता है। संवर्धन पोत से \(CO_2\) को हटाने के परिणामस्वरूप Nicotiana tobaccum में परागकोश संवर्धन प्रतिक्रिया में अवक्रमण आई।
• प्रकाश का प्रभाव (Effect of light): पृथक पराग संवर्धन परागकोश संवर्धन की तुलना में प्रकाश के प्रति अधिक संवेदनशील (Sensitive) है।

अनुप्रयोग (Applications)

• द्विगुणितों का उत्पादन (Production of diploids): पर-परागण (Cross pollinating) प्रजातियों और संकरों की समयुग्मजी रेखाएं (Homozygous lines) चयन की दक्षता और समयुग्मजी पौधों के उत्पादन को बढ़ाने के लिए अत्यधिक वांछनीय हैं। समयुग्मजी पौधों के उत्पादन की पारंपरिक विधि लंबी और श्रमसाध्य है, जिसमें अंतःप्रजनन (Inbreeding) के 7-8 आवर्तक चक्र (Recurrent cycles) की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, यह दृष्टिकोण स्व-असंगत (Self-incompatible) और नर बाँझ (Male sterile) और वृक्ष प्रजातियों के लिए अव्यावहारिक (Impractical) है। दूसरी ओर, अगुणित के द्विगुणन (Diploidization) द्वारा एक ही पीढ़ी में समयुग्मजी पौधे प्राप्त किए जा सकते हैं। एक ही पीढ़ी में स्थिर, समयुग्मजी डायहेप्लॉइड्स (DH) का इस प्रकार का उत्पादन वंशावली प्रजनन (Pedigree breeding) की \(F_\alpha\) पीढ़ी के बराबर है और इस प्रकार प्रजनन चक्र को काफी छोटा कर देता है। आम तौर पर, पराग पौधों को द्विगुणित करने के लिए कोल्चिसिन (Colchicine) की सिफारिश की जाती है। व्यवहार में, पराग व्युत्पन्न पौधों को कोल्चिसिन के फिल्टर निष्फल समाधान (Filter sterilized solution) में डुबोया जाता है या लैनोलिन पेस्ट (Lanolin paste) के रूप में लगाया जाता है या द्वितीयक कलियों में इंजेक्ट किया जाता है या जड़ खिलाने (Root feeding) द्वारा किया जाता है। गुणसूत्र दोहराव (Chromosome duplication) लाने के अलावा, कोल्चिसिन उपचार के परिणामस्वरूप गुणसूत्र और जीन अस्थिरता (Instabilities) भी हो सकती है। इसलिए, लंबे समय तक संवर्धन में विभेदित पादप कोशिकाओं (कॉर्टेक्स, पिथ) और कैलस कोशिकाओं में गुणसूत्रों के स्वतः दोहराव (Spontaneous duplication) की लगातार घटना का उपयोग अगुणित पौधों से समयुग्मजी उपजाऊ द्विगुणित (Homozygous fertile diploids) पैदा करने के लिए भी किया गया है (चित्र)। इस विधि में, वनस्पति भागों जैसे कि तना, जड़ या डंठल (Petiole) खंडों के टुकड़ों को कैलस (Callusing) प्रेरित करने के लिए एक उपयुक्त माध्यम में संवर्धित किया जाता है। प्रारंभिक कैलस में कुछ द्विगुणित कोशिकाएं हो सकती हैं लेकिन बार-बार उप-संवर्धन में उनकी आवृत्ति बढ़ जाएगी। ऐसे कैली को पादप पुनर्जनन माध्यम (Plant regeneration medium) में स्थानांतरित किया जाता है। इस प्रकार प्राप्त कई पौधे द्विगुणित होते हैं। हालांकि, आगे के प्रयोगों में उन्हें शामिल करने से पहले व्यक्तिगत पौधों की प्लॉइडी की पुष्टि की जानी चाहिए।
• आम तौर पर, एक संकरण कार्यक्रम में लाइनों का मूल्यांकन बैकक्रॉसिंग (Backcrossing) के 4-5 वर्षों (\(F_5\) या \(F_6\) पीढ़ी) के बाद ही संभव है और एक नई किस्म जारी करने में 4-5 साल और लगते हैं। \(F_1\) संकरों के परागकोश संवर्धन द्वारा युग्मकों (Gametes) के विभिन्न जीनोटाइप को तय किया जा सकता है और पहली पीढ़ी में उनका मूल्यांकन किया जा सकता है। परागकोश संवर्धन अपने आप में नए पुनर्संयोजन (Recombination) उत्पन्न कर सकता है और उन्हें एक साथ तय कर सकता है।
• अगुणित अप्रभावी उत्परिवर्ती (Recessive mutants) का पता लगाने के लिए बेहद उपयोगी होते हैं जो विषमयुग्मजी द्विगुणित (Heterozygous diploid) पृष्ठभूमि में खुद को व्यक्त नहीं कर सकते हैं और इसलिए आसानी से खो सकते हैं।
• गैमेटोक्लोनल भिन्नता (Gametoclonal variation): इन विट्रो एण्ड्रोजेनेसिस अर्धसूत्रीविभाजन (Meiosis) के दौरान पुनर्संयोजन और अलगाव (Segregation) के कारण होने वाली युग्मकोद्भिद भिन्नता (Gametophytic variation) की जांच करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, टमाटर का एक गैमेटोक्लोन (Gametoclone), जिसमें मूल किस्म की तुलना में अधिक ठोस सामग्री वाले फल लगते हैं, परागकोश संवर्धन के माध्यम से तैयार किया गया है।
• उत्परिवर्तनजनन (Mutagenesis): अगुणित अवस्था में अप्रभावी उत्परिवर्ती का पता लगाना और अलगाव करना तथा समयुग्मजी द्विगुणित अवस्था में उत्परिवर्तित जीन की तेजी से प्राप्ति उच्च पौधों में अगुणित की एक विशेष योग्यता है। सूक्ष्मबीजाणु (Microspore) चरण में म्यूटाजेनिक उपचार के अनुप्रयोग, जो एक एकल कोशिका संरचना है, का ठोस उत्परिवर्ती प्राप्त करने का अतिरिक्त लाभ है। सूक्ष्मबीजाणु उत्परिवर्तन के माध्यम से, उच्च ओलिक (Oleic) और कम लिनोलिक एसिड (Linoleic acid) सामग्री वाले Brassica napus का एक उत्परिवर्ती प्राप्त किया गया था।
• Asparagus officinalis के सुपर नर का उत्पादन (Production of super male of Asparagus officinalis): A. officinalis में, एक डायोइसियस (Dioecious) फसल प्रजाति, और एक इनब्रेड (Inbred) आबादी पिस्टिलेट (Pistillate) और स्टैमिनेट (Staminate) पौधों के बीच सिब क्रॉस (Sib crosses) के माध्यम से उत्पन्न होती है जो 50% नर और 50% मादा पैदा करती है। हालांकि, इस फसल की व्यावसायिक रूप से वांछनीय विशेषताएं कम फाइबर सामग्री वाले स्पीयर्स (Spears) के साथ एकसमान पुरुष आबादी हैं। इस प्रजाति के अगुणित उत्पन्न करने के लिए परागकोश संवर्धन का उपयोग किया गया था और समयुग्मजी नर उगाने के लिए इसे द्विगुणित किया गया था। इन्हें सुपर-नर (Super-males) कहा जाता है।

यह आरेख परागकोश और पृथक पराग संवर्धन (Isolated pollen culture) के विभिन्न चरणों को दर्शाता है। परागकोश से अगुणित पौधे तक परागकोश संवर्धन के चरणों को इस प्रकार वर्णित किया जा सकता है: a) एक बिना खिली फूल की कली, 1b) परागकोश, 1c) संवर्धन में परागकोश, 1d) और 1e) प्रोलिफरेटिंग परागकोश (Proliferating anther), 1f) अगुणित कैलस (Haploid callus), 1g) विभेदक कैलस (Differentiating callus), h) अगुणित पौधा (Haploid plantlet)। पृथक पराग संवर्धन इस प्रकार है: a) एक बिना खिली फूल की कली, 3b) एक संवर्धित परागकोश से पृथक पराग, 3c) पराग संवर्धन, 3d) बहु-नाभिकीय पराग (Multinucleate pollen), 3e) और 3f) पराग भ्रूण।

सीमाएँ (Limitations)

• कम उपज (Low Yield): आम तौर पर एक प्रतिक्रिया देने वाले परागकोश में कुल पराग कणों का 5-8% ही एण्ड्रोजेनिक विकास से गुजरता है।
• पराग की संरचनात्मक, शारीरिक और जैव रासायनिक असामान्यताओं (Abnormalities) के कारण 70-80% भ्रूण सामान्य अंकुरण (Germination) में असमर्थ होते हैं।
• अनाज में ऐल्बिनो (Albinos) की उच्च आवृत्तियों की घटना।
• एण्ड्रोजेनेसिस के दौरान आनुवंशिक सामग्री की अस्थिरता (Instability)।

सूक्ष्मबीजाणु संवर्धन (Microspore culture)

अगुणितों के उत्पादन के लिए आदर्श संवर्धन प्रणाली परागकोश की दीवार के ऊतकों से अलग होने के बाद सूक्ष्मबीजाणुओं (Microspores) का अलगाव और संवर्धन है।

कारण (Reasons)

परागकोश के ऊतकों का प्रभाव हानिकारक (Detrimental) हो सकता है।

द्विगुणित ऊतक (Diploid tissue): संयोजी ऊतक (Connective tissue) बढ़ती हुई गतिविधि है जो अगुणित सूक्ष्मबीजाणु के विकास के साथ प्रतिस्पर्धी (Competitive) है जो जल्द ही प्रचुर द्विगुणित कैलस (Profuse diploid callus) से जलमग्न हो जाता है। इसलिए, संवर्धन के दौरान परिवर्तनशील और कई गुणसूत्र परिवर्तन देखे जाते हैं。

विधियाँ (Methods)

• स्वतः (Spontaneous): पूर्व-उपचार (Pretreatment) और ऊष्मायन (Incubation) का संयोजन दिया जाता है। - परागकोश तरल माध्यम में विदीर्ण (Dehisce) हो जाएंगे और कैलस/भ्रूण उत्पन्न करेंगे जो दैहिक ऊतक (Somatic tissue) से तैरेंगे। उदाहरण के लिए, Brassica, अनाज (Cereals), Solanaceae।
• समरूपीकरण और निस्पंदन (Homogenisation and filtration): पूर्व-उपचारित परागकोशों को 3-4 दिनों के लिए संवर्धित किया जाता है, सूक्ष्मबीजाणुओं को बाहर निकालने के लिए तरल माध्यम में एक ग्लास रॉड/सीरिंज पिस्टन (Glass rod/syringe piston) के साथ धीरे से कुचला जाता है। परागकोशों और सूक्ष्मबीजाणुओं वाले निलंबन को नायलॉन की छलनी (Nylon sieve) के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है जो सूक्ष्मबीजाणु को गुजरने देता है। निस्यंद (Filtrate) को 100 g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। सतह पर तैरने वाले तरल (Supernatant) को त्यागने के बाद, पराग को कम से कम एक बार धो लें और पेट्रीडिश (Petridish) में प्रारंभिक घनत्व पर तरल माध्यम में फिर से निलंबित करें और इनक्यूबेट (Incubate) करें। (उदाहरण के लिए Solanaceae, रेप (Rape), गन्ना)
• स्लिट तकनीक (Slit technique): प्राकृतिक विदर (Natural dehiscence) पर भरोसा करने के बजाय सूक्ष्मबीजाणु कैलस/भ्रूण को मुक्त करने के लिए परागकोश की दीवार को काटना, लेकिन यह एक समय लेने वाली प्रक्रिया है (उदाहरण के लिए) तंबाकू।

अगुणितों के उपयोग (Uses of haploids)

• स्व-परागित (Self pollinated) फसलों में समयुग्मजी किस्मों (Homozygous varieties) का उत्पादन।
• पर-परागण वाली फसलों में, इच्छित एकल क्रॉस (Single cross) या डबल क्रॉस (Double cross) संकर के माता-पिता के रूप में उपयोग के लिए शुद्ध रेखाओं (Pure lines) के विषमयुग्मजी सामग्री (Heterozygous material) से व्युत्पत्ति।
• अगुणितों का स्पष्ट लाभ यह है कि वे एकल खुराक (Single dose) में क्रमिक प्रभावों (Successive effects) के साथ उत्परिवर्तन (Mutations) प्रदर्शित करते हैं।
• रूपांतरण (Transformation) पर गुणसूत्र दोहरीकरण (Chromosome doubling) द्वारा प्रभावी निर्धारण (Effective fixation)।
• डबल अगुणित पौधों (Double haploid plants) का उपयोग उत्परिवर्तन, जैव रासायनिक और शारीरिक अध्ययनों में भी किया जाता है।
• फफूंदी (Mildew) और पीला मोज़ेक (Yellow mosaic) के लिए शुद्ध रेखाओं और रोग प्रतिरोधी रेखाओं का विकास - जौ
• मक्का में अनिषेकजननिक (Parthenogenetic) अगुणित
• जंगली और घरेलू प्रजातियों के बीच यौन अंतर-विशिष्ट संकरों (Sexual inter specific hybrids) की रिकवरी - टमाटर
• शतावरी (Asparagus) में शुद्ध रेखाओं और 100% नर पौधों का विकास
• कॉफी में रोग प्रतिरोध के लिए जटिल संकर (Complex hybrids)

प्रश्न (Questions)

1. वर्तमान में अगुणित उत्पादन (Haploid production) के लिए उपयोग की जाने वाली सबसे महत्वपूर्ण विधियों में शामिल हैं ……….
   1. परागकोश या पराग संवर्धन (Anther or pollen culture)
   2. बीजांड संवर्धन (Ovule culture)
   3. बल्बोसम तकनीक
   4. उपरोक्त सभी (All the above)
2. बल्बोसम तकनीक है ……..
   1. गुणसूत्र विलोपन
   2. अंतर-विशिष्ट संकरण के बाद गुणसूत्र विलोपन
   3. अंतः-विशिष्ट संकरण (Intraspecific hybridization) के बाद गुणसूत्र विलोपन
   4. उपरोक्त में से कोई नहीं (None of the above)
3. बल्बोसम तकनीक का उपयोग किसके लिए किया जाता है ……..
   1. अगुणित उत्पादन
   2. त्रिगुणित उत्पादन (Triploid production)
   3. चतुर्गुणित उत्पादन (Tetraploid production)
   4. उपरोक्त में से कोई नहीं
4. Datura innoxia के परागकोश संवर्धन (Anther culture) में कई पराग पौधों के विकास को सबसे पहले किसके द्वारा रिपोर्ट किया गया था ………………
   1. गुहा (Guha)
   2. माहेश्वरी (Maheswari)
   3. a और b दोनों (Both a & b)
   4. उपरोक्त में से कोई नहीं
5. अनिषेकजनन की प्रक्रिया है ………………
   1. निषेचित अंडे से भ्रूण का विकास (Embryo development from fertilized egg)
   2. अनिषेचित अंडे से भ्रूण का विकास (Embryo development from unfertilized egg)
   3. भ्रूण का विकास (Embryo development)
   4. उपरोक्त में से कोई नहीं
6. अगुणित उत्पादन की क्षमता ………………
   1. दाता पौधों की उम्र के साथ घट जाती है (Declines with age of donor plants)
   2. दाता पौधों की उम्र के साथ बढ़ जाती है (Increases with age of donor plants)
   3. दाता पौधों की उम्र से अप्रभावित रहती है (Unaffected with age of donor plants)
   4. उपरोक्त में से कोई नहीं
7. पराग संवर्धन (Pollen culture) में, संवर्धित परागकोशों से पराग कणों का अलगाव किसके द्वारा होता है ………………
   1. यांत्रिक विधि (Mechanical method)
   2. फ्लोट कल्चर विधि
   3. a और b दोनों (Both a & b)
   4. उपरोक्त में से कोई नहीं
8. पराग द्विरूपता किसके द्वारा प्रदर्शित की जाती है ………………
   1. तंबाकू (Tobacco)
   2. गेहूं (Wheat)
   3. जौ
   4. उपरोक्त सभी
9. इन विट्रो एण्ड्रोजेनेसिस को संवर्धित परागकोशों/पराग कणों के पूर्व-उपचार द्वारा बढ़ावा दिया जाता है, अर्थात ………
   1. तापमान का झटका (Temperature shock)
   2. अपकेंद्रण
   3. γ विकिरण (γ irradiation)
   4. उपरोक्त सभी
10. .............. के जुड़ने से एण्ड्रोजेनेसिस की सफलता दर में वृद्धि पाई गई।
    1. एथरेल (Ethrel)
    2. सुक्रोज
    3. विशिष्ट जीनोटाइप के लिए विशिष्ट पोषक तत्व (Nutrients specific to certain genotype)
    4. उपरोक्त सभी