अंडाशय और भ्रूण संवर्धन (Ovary and embryo culture)

अंड कोशिका (egg cell) या भ्रूण कोष (embryo sac) की अन्य अगुणित (haploid) कोशिकाओं से अगुणित पौधे प्राप्त करने के लिए अनिषेचित (unfertilized) अंडाशय के संवर्धन को अंडाशय संवर्धन (ovary culture) कहा जाता है और इस प्रक्रिया को गायनोजेनेसिस (gynogenesis) कहा जाता है। सैन नोएम (San Noem) ने पहली बार 1976 में जौ (barley) में गायनोजेनेसिस की सूचना दी थी। इसके बाद, गेहूं (wheat), चावल (rice), मक्का (maize), तंबाकू (tobacco), चुकंदर (sugar beet), रबर (rubber) आदि सहित कई प्रजातियों में सफलता प्राप्त की गई है। संवर्धित अंडाशयों में से लगभग 0.2-6% गायनोजेनेसिस दिखाते हैं और प्रत्येक अंडाशय से एक या दो, शायद ही कभी 8 तक, पौधे (plantlets) उत्पन्न होते हैं। सफलता की दर निम्नलिखित के साथ काफी भिन्न होती है:

• प्रजातियां (Species)
• यह आनुवंशिक संरचना (genotype) से काफी प्रभावित होता है जिससे कुछ किस्में बिल्कुल प्रतिक्रिया नहीं देती हैं। उदाहरण के लिए, चावल में, जपोनिका (japonica) जीनोटाइप इंडिका (indica) जीनोटाइप की तुलना में बहुत अधिक प्रतिक्रियाशील होते हैं।
• अंडाशय के विकास का चरण (Stage of ovary development): ज्यादातर मामलों में, अंडाशय संवर्धन के लिए इष्टतम चरण लगभग परिपक्व भ्रूण कोष (mature embryo sac) होता है, लेकिन चावल में मुक्त परमाणु भ्रूण कोष (free nuclear embryo sac) चरण में अंडाशय सबसे अधिक प्रतिक्रियाशील होते हैं। आमतौर पर, पूरे फूल, अंडाशय और प्लेसेंटा (placenta) से जुड़े बीजांड (ovules) का संवर्धन बेहतर प्रतिक्रिया देता है, लेकिन जरबेरा (Gerbera) और सूरजमुखी (Sunflower) में पृथक बीजांड बेहतर प्रतिक्रिया दिखाते हैं। अंडाशय संवर्धन से पहले पुष्पक्रम (inflorescence) का शीत पूर्व-उपचार (Cold pretreatment) (सूरजमुखी में 4°C पर 24-48 घंटे और चावल में 7°C पर 24 घंटे) गायनोजेनेसिस को बढ़ाता है।
• वृद्धि नियामक (Growth regulators): गायनोजेनेसिस में वृद्धि नियामक महत्वपूर्ण होते हैं और उच्च स्तर पर वे दैहिक ऊतकों (somatic tissues) के कैलस (callusing) को प्रेरित कर सकते हैं और यहां तक कि गायनोजेनेसिस को दबा सकते हैं। वृद्धि नियामकों की आवश्यकता प्रजातियों पर निर्भर करती है। उदाहरण के लिए, सूरजमुखी में, GR-मुक्त माध्यम सबसे अच्छा है, जबकि निम्न स्तर पर भी MCPA (2-मिथाइल-4-क्लोरोफेनोक्सीएसिटिक एसिड) दैहिक कैलस (somatic calli) और दैहिक भ्रूण (somatic embryos - SEs) को प्रेरित करता है। लेकिन चावल में, गायनोजेनेसिस के लिए 0.125-0.5 mg/l MCPA इष्टतम है।
• अन्य कारक (Other Factors): सुक्रोज (Sucrose) का स्तर भी महत्वपूर्ण प्रतीत होता है। सूरजमुखी में, 12% सुक्रोज गायनोजेनिक भ्रूण उत्पादन की ओर ले जाता है, जबकि निचले स्तरों पर दैहिक कैलस और दैहिक भ्रूण भी उत्पादित होते हैं। अंडाशय/बीजांड आमतौर पर प्रकाश में संवर्धित किए जाते हैं, लेकिन कम से कम कुछ प्रजातियों में, उदाहरण के लिए, सूरजमुखी और चावल, अंधेरे में ऊष्मायन (dark incubation) गायनोजेनेसिस का पक्ष लेता है और दैहिक कैलस बनने को कम करता है। चावल में, प्रकाश गायनोजेनिक प्राक-भ्रूण (proembryos) के पतन (degeneration) का कारण बन सकता है।

विकासात्मक चरण (Developmental stages)

आमतौर पर, गायनोजेनेसिस के दो या कई चरण होते हैं और प्रत्येक चरण की अलग-अलग आवश्यकताएं होती हैं। चावल में, दो चरणों अर्थात प्रेरण (induction) और पुनर्जनन (regeneration) को मान्यता दी गई है। प्रेरण के दौरान, अंडाशयों को कम ऑक्सिन (auxin) वाले तरल माध्यम पर तैराया जाता है और अंधेरे में रखा जाता है, जबकि पुनर्जनन के लिए उन्हें उच्च ऑक्सिन सांद्रता वाले अगर (agar) माध्यम पर स्थानांतरित किया जाता है और प्रकाश में ऊष्मायन किया जाता है।

अगुणित पौधे आमतौर पर अधिकांश प्रजातियों में अंड कोशिका से उत्पन्न होते हैं (इन विट्रो पार्थेनोजेनेसिस - in vitro parthenogenesis) लेकिन कुछ प्रजातियों में, उदाहरण के लिए, चावल, वे मुख्य रूप से सिनर्जिड्स (synergids) से उत्पन्न होते हैं; कम से कम एलियम ट्यूबरोसम (Allium tuberosum) में यहां तक कि एंटीपोडल (antipodals) भी अगुणित पौधे उत्पन्न करते हैं (इन विट्रो एपोगैमी - in vitro apogamy)। एंथर कल्चर (anther culture) की तरह, गायनोजेनेसिस भ्रूणजनन (embryogenesis) के माध्यम से या कैलस (callus) से पौधे के पुनर्जनन (plantlet regeneration) के माध्यम से हो सकता है। चावल में MCPA आमतौर पर कैलस निर्माण की तरह एक छोटी मात्रा में प्रोटोकोर्म (protocorm) की ओर ले जाता है जिससे प्ररोह (shoots) और जड़ें (roots) पुनर्जीवित होती हैं, जबकि पिक्लोरम (picloram) भ्रूण पुनर्जनन को बढ़ावा देता है। इसके विपरीत, चुकंदर आमतौर पर भ्रूण विकास दिखाता है, जबकि सूरजमुखी में कैलस चरण के बाद भ्रूण पुनर्जीवित होते हैं। सामान्य तौर पर, कैलस चरण से पुनर्जनन, कम से कम वर्तमान के लिए, प्रत्यक्ष भ्रूणजनन की तुलना में आसान प्रतीत होता है।

लाभ (Advantages)

1. गायनोजेनेटिक अगुणित उन मामलों में समयुग्मजी (homozygous) लाइनों के उत्पादन के लिए एक मूल्यवान विकल्प हो सकते हैं जहां साइटोप्लाज्मिक नर बंध्यता (cytoplasmic male sterility) माइक्रोस्पोर (microspores) के उपयोग को रोकती है।
2. कुछ प्रजातियों विशेषकर अनाज (cereals) में एल्बिनो (albino) पौधों की आवृत्ति में कमी।

सीमाएं (Limitations)

1. अब तक यह केवल दो दर्जन से कम प्रजातियों में सफल रहा है।
2. प्रतिक्रिया देने वाले अंडाशयों (1-5%) की आवृत्ति और पौधे/अंडाशय (1-2) की संख्या काफी कम है।
3. इसलिए, अंडाशय संवर्धन की तुलना में परागकोष संवर्धन को प्राथमिकता दी जाती है। केवल उन मामलों में जहां परागकोष संवर्धन विफल हो जाता है, उदाहरण के लिए चुकंदर और नर बंध्य (male sterile) लाइनों के लिए, अंडाशय संवर्धन महत्व रखता है।

भ्रूण संवर्धन (Embryo culture)

एंजियोस्पर्म (angiosperms) में भ्रूण (embryo) निषेचित अंडे (fertilized egg) या युग्मनज (zygote) के परिणामस्वरूप होने वाला सूक्ष्म बीजाणुद्भिद (miniature sporophyte) है। बीज वाले पौधों में, भ्रूण आसानी से सुलभ होते हैं क्योंकि उन्हें मातृ ऊतकों (maternal tissues) से आसानी से अलग किया जा सकता है और ज्ञात रासायनिक संरचना के मीडिया में एसेप्टिक (aseptic) स्थितियों के तहत इन विट्रो (in vitro) संवर्धित किया जा सकता है। आधी सदी से भी अधिक समय से पादप प्रजनकों (plant breeders) द्वारा भ्रूण के संवर्धन का अभ्यास किया जा रहा है।

एसेप्टिक स्थितियों के तहत इन विट्रो में एंजियोस्पर्म के भ्रूण को विकसित करने का पहला व्यवस्थित प्रयास हैनिंग (Hanning, 1904) द्वारा किया गया था, जिन्होंने मूली (Raphanus) और कोनिफ़र कोक्लेरिया (conifers Cochlearia) के परिपक्व भ्रूणों का संवर्धन किया था। इसके बाद, कई शोधकर्ताओं ने परिपक्व बीजों से निकाले गए भ्रूणों को काटकर पौधे उगाए। भ्रूण संवर्धन के क्षेत्र में आगे की प्रगति लिबैक (Liabach, 1925, 1929) द्वारा प्रदान की गई थी, जिन्होंने इस तकनीक के सबसे महत्वपूर्ण व्यावहारिक अनुप्रयोग (practical application) का प्रदर्शन किया था। उन्होंने Linum perenne को Linum austriacum के साथ क्रॉस (cross) किया, लेकिन बिना किसी अंकुरण क्षमता (germinability) के बहुत हल्के और सिकुड़े हुए स्वभाव के संकर बीज (hybrid seeds) प्राप्त किए। ऐसे बीजों से निकाले गए भ्रूणों को सुक्रोज घोल में डूबे नम फिल्टर पेपर (filter paper) पर संवर्धित किया गया था। इससे संकर पौधों (hybrid plants) का उत्पादन हुआ। तब से, भ्रूण संवर्धन तकनीक का उपयोग संकर उत्पन्न करने के लिए व्यापक रूप से किया गया है जो अन्यथा भ्रूण के गर्भपात (embryo abortion) के कारण संभव नहीं थे। इसके अलावा, भ्रूण संवर्धन विधि भ्रूण के विकास और पौधों में संबंधित समस्याओं को चिह्नित करने के लिए नए परिष्कृत तरीके प्रदान करती है।

भ्रूण संवर्धन के लिए उपयोग किए जाने वाले पौधे का चयन सामान्य रूप से हाथ में मौजूद समस्या द्वारा निर्धारित किया जाता है। जब लक्ष्य अन्यथा गर्भपात वाले बीजों (abortive seeds) से पौधे प्राप्त करना होता है, तो गर्भपात (abortion) शुरू होने से पहले संवर्धन के लिए भ्रूण को निकाल दिया जाना चाहिए। युग्मनज भ्रूण (Zygotic embryos), बीजांड (ovular) और डिम्बग्रंथि (ovarian) ऊतकों के बाँझ (sterile) वातावरण के भीतर संलग्न होने के कारण, सतह नसबंदी (surface sterilization) की आवश्यकता नहीं होती है। सतह नसबंदी के मानक तरीकों का पालन करते हुए पूरे बीजांड को कीटाणुरहित किया जाता है और भ्रूणों को विच्छेदित (dissect) करके एसेप्टिक स्थितियों के तहत संवर्धन माध्यम (culture medium) में स्थानांतरित किया जाता है।

आम तौर पर भ्रूण के इन विट्रो संवर्धन के लिए, उन्हें उनके आसपास के ऊतकों से काटना (excise) आवश्यक होता है। परिपक्व भ्रूणों (mature embryos) को बीजों को विभाजित करके आसानी से अलग किया जा सकता है। कठोर बीज आवरण (hard seed coat) वाले बीजों को पानी में भिगोने के बाद विच्छेदित किया जाता है। छोटे बीजों वाले पौधों के लिए, भ्रूण का अलगाव एक निष्फल (sterilized) स्लाइड पर विच्छेदन माइक्रोस्कोप (dissecting microscope) के तहत किया जा सकता है। ऑर्किड (orchids) जैसे पौधों में, जहां बीज छोटे होते हैं और कार्यात्मक भ्रूणपोष (functional endosperm) की कमी होती है, भ्रूण वाले पूरे बीजांड माध्यम पर संवर्धित होते हैं।

प्रकार (Types)

• कच्चे बीजों (unripe seeds) से उत्पन्न अपरिपक्व भ्रूणों (immature embryos) का संवर्धन, जो मुख्य रूप से एक जीवनक्षम (viable) पौधे के उत्पादन के उद्देश्य से भ्रूण के गर्भपात से बचने के लिए होता है।
• पके बीजों (ripe seeds) से प्राप्त परिपक्व भ्रूणों का संवर्धन।

भ्रूण संवर्धन की सफलता को प्रभावित करने वाले कारक (Factors affecting the success of embryo culture)

भ्रूण संवर्धन विधि के अनुप्रयोग को स्पष्ट करने का प्रयास करने से पहले, भ्रूण संवर्धन तकनीक को प्रभावित करने वाले कारकों का संक्षेप में विश्लेषण करना आवश्यक है।

• जीनोटाइप (Genotypes)
• अलगाव के समय भ्रूण का विकासात्मक चरण (Developmental stage of the embryo at isolation): बहुत युवा भ्रूणों का संवर्धन बहुत मुश्किल है। भ्रूण संवर्धन के क्षेत्र में काफी प्रगति के बावजूद, भ्रूण बचाव (embryo rescuing) मुश्किल लगता है जहां भ्रूण गर्भपात विकास के बहुत शुरुआती चरण में होता है। बहुत युवा भ्रूणों को सफलतापूर्वक संवर्धित करने के लिए, किसी विशेष प्रजाति के भ्रूण को उसी प्रजाति के दूसरे बीज के भ्रूणपोष (endosperm) में प्रत्यारोपित (implant) किया जाता है। उदाहरण के लिए, Hordeum x Secale के क्रॉस में प्रत्यारोपण तकनीक (implantation technique) के साथ जीवित रहने की दर 30-40 प्रतिशत थी, जबकि भ्रूण संवर्धन की पारंपरिक विधि के साथ यह एक प्रतिशत थी। इस तकनीक को भ्रूण-नर्स भ्रूणपोष प्रत्यारोपण तकनीक (embryo-nurse endosperm transplant technique) कहा जाता है।
• मातृ पौधे की वृद्धि की स्थिति (Growth conditions of the mother plant)
• पोषक माध्यम की संरचना (Composition of the nutrient media): भ्रूण संवर्धन का सबसे महत्वपूर्ण पहलू सही संवर्धन माध्यम का चयन है जो विकास के विभिन्न चरणों में निकाले गए भ्रूणों के प्रगतिशील और व्यवस्थित विकास का समर्थन करेगा। संवर्धन माध्यम की आवश्यकता भ्रूण संवर्धन के प्रकारों पर निर्भर करती है। वे या तो अंकुरण के बाद (post-germinal) या अंकुरण से पहले (pre-germinal) हो सकते हैं। अंकुरण के बाद के भ्रूण संवर्धन के मामले में, अंकुरण के बाद की प्रक्रिया को तेज करने के लिए केवल भ्रूणों का संवर्धन किया जाता है। इसे कम जटिल माध्यम या यहां तक कि सुक्रोज या ग्लूकोज (glucose) घोल से प्राप्त किया जा सकता है। पूर्व-अंकुरण भ्रूण संवर्धन में, अपरिपक्व भ्रूण को पौधे प्राप्त करने के लिए संवर्धित किया जाता है, जहां भ्रूण को एक जटिल पोषक माध्यम (complex nutrient medium) की आवश्यकता होती है। भ्रूण के संवर्धन के लिए पोषक माध्यम के शोधन (Refinement) में किसी भी अन्य प्रकार के पादप ऊतक संवर्धन की तरह खनिज लवण (mineral salts), कार्बनिक पोषक तत्वों (organic nutrients) और वृद्धि नियामकों की संरचना में संशोधन शामिल है। संवर्धन माध्यम की संरचना को भ्रूण के विकासात्मक चरण के अनुकूल बनाने के लिए तैयार किया जाना चाहिए। भ्रूण के विकास में दो चरण होते हैं (1) हेटरोट्रॉफ़िक चरण (heterotrophic phase) जिसमें भ्रूण अपने पोषक तत्वों को भ्रूणपोष और आसपास के मातृ ऊतकों से खींचता है और (2) ऑटोट्रॉफ़िक चरण (autotrophic phase) जिसमें भ्रूण विकास के लिए आवश्यक पदार्थों को संश्लेषित (synthesize) करने में चयापचय (metabolically) रूप से सक्षम होता है। अमीनो एसिड (amino acids) और विटामिन (vitamins) को जोड़ने से भ्रूण के विकास को बढ़ावा मिलता है। कैसिइन हाइड्रोलाइज़ेट (Casein hydrolysate), एक अमीनो एसिड कॉम्प्लेक्स को भ्रूण संवर्धन मीडिया में एक योज्य (additive) के रूप में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। प्राकृतिक पौधों के अर्क (natural plant extracts) जैसे नारियल का दूध (coconut milk), टमाटर का रस (tomato juice) और केले के अर्क भ्रूण के विकास और विकास की उच्च वसूली का उत्पादन करते हैं। वृद्धि हार्मोन (Growth hormones), विशेष रूप से ऑक्सिन (auxins) का उपयोग भ्रूण संवर्धन मीडिया में नहीं किया जाता है क्योंकि भ्रूण के विकास में उनकी निरोधात्मक भूमिका (inhibitory role) होती है जिसके परिणामस्वरूप संरचनात्मक असामान्यताएं (structural abnormalities) होती हैं।
• सस्पेंसर और भ्रूण संवर्धन (Suspensor and embryo culture): सस्पेंसर (suspensor) प्राक-भ्रूण (proembryo) के मूलांकुर (radicle) छोर पर पाई जाने वाली क्षणभंगुर संरचना (transitory structure) है। यह युवा भ्रूणों के विकास को बढ़ावा देता है और भ्रूण के विकास के बाद के चरणों में, अर्थात बीजपत्रों (cotyledons) के निर्माण के बाद पतित (degenerate) हो जाता है। ज्यादातर निलंबन (suspension) के बिना संवर्धित भ्रूण कम जीवित रहने और अधिकतम परिगलन (necrosis) दिखाते हैं जिससे पौधे के निर्माण की आवृत्ति कम हो जाती है।
• प्रकाश (Light)
• तापमान (Temperature)

व्यावहारिक अनुप्रयोग (Practical applications)

दूर के संकरण में भ्रूण बचाव (Embryo rescue in wide crosses)

पौधों में भ्रूण की अक्षमता (embryo inviability) कई कारणों से होती है, हालांकि प्रारंभिक अवस्था में सामान्य निषेचन (fertilization) और विकास होता है। इसके बाद हानियाँ शुरू होती हैं, जिसके परिणामस्वरूप भ्रूण या भ्रूणपोष से या आसपास के मातृ ऊतक (maternal tissue) से भ्रूण की मृत्यु हो जाती है।

संकर (hybrids) प्राप्त करने के लिए उपरोक्त बाधाओं को दूर करने के लिए, भ्रूण संवर्धन तकनीक का प्रभावी ढंग से उपयोग किया जाता है जिसमें कृत्रिम माध्यम प्रदान करके भ्रूण और भ्रूणपोष के बीच पोषण संबंधी संबंध (nutritional relationship) बहाल किया जाता है ताकि संकर भ्रूणों के विकास को प्रेरित और पूरा किया जा सके और इसे भ्रूण बचाव कहा जाता है। पोषक तत्वों (nutrients) के साथ आपूर्ति किए गए कृत्रिम माध्यम में सफलतापूर्वक बढ़ने के लिए गैर-जीवनक्षम बीजों (non-viable seeds) से निकाले गए भ्रूणों की क्षमता के प्रदर्शन ने दूर के संकरण (wide hybridization) की समस्याओं को दरकिनार कर दिया और कीटों और बीमारियों और विभिन्न पर्यावरणीय तनावों (environmental stresses) के लिए प्रतिरोधी जीन (resistant genes) को खेती की जाने वाली प्रजातियों में स्थानांतरित करने में सक्षम बनाया।

भ्रूण संवर्धन तकनीक न केवल अंतर-विशिष्ट संकर (interspecific hybrids) उत्पन्न करने के लिए अपनाई जाती है, बल्कि जेनेरा (genera) के बीच जीवनक्षम संकर उत्पन्न करने के लिए भी विस्तारित की जाती है। इंटरजेनेरिक संकर (Intergeneric hybrids) Hordeum और Secale; Hordeum और Hordelymus; Triticum और Elymus; Triticum और Secale और Tripsacum और Zea के बीच प्राप्त किए गए हैं।

हालाँकि, अंतर-विशिष्ट और इंटरजेनेरिक क्रॉस में सफल भ्रूण बचाव के लिए, कृत्रिम पोषक माध्यम की संरचना बहुत महत्वपूर्ण है। कारण यह है कि एक संकर संयोजन (hybrid combination) के भ्रूण के विकास को बढ़ावा देने के लिए तैयार किया गया माध्यम दूसरे के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। भ्रूण के विकास को प्रेरित करने में कृत्रिम माध्यम में बाधाओं को दूर करने के लिए, निम्नलिखित तकनीक का पालन किया जाता है जिसमें संकर भ्रूणपोष में एम्बेडेड (embedded) संकर भ्रूणों को हटा दिया जाता है और सामान्य भ्रूणपोष में प्रत्यारोपित (transplanted) या प्रत्यारोपित (implanted) किया जाता है। इस तकनीक को भ्रूण प्रत्यारोपण (embryo implantation) कहा जाता है। यह तकनीक पहली बार 1944 में पिसरेव (Pissarev) और विनोग्रादोवा (Vinogradova) द्वारा प्रस्तावित की गई थी। भ्रूण प्रत्यारोपण तकनीक दो प्रजातियों के बीच पारगम्यता (crossability) में सुधार करने का एक विकल्प हो सकती है। क्रूस (Kruse, 1974) ने Hordeum x Triticale, Hordeum x Agropyron और Hordeum x Secale क्रॉस से संकर भ्रूणों को बचाने के लिए एक समान विधि का प्रस्ताव रखा। संकर भ्रूण को एक छिलके रहित कैरियोप्सिस (dehulled caryopsis) से निकाल दिया जाता है और एक संवर्धन माध्यम में रखे Hordeum के भ्रूणपोष में सही स्थिति में रखा जाता है।

मोनोप्लॉइड उत्पादन (Monoploid production)

आनुवंशिकी या पादप प्रजनन में उपकरण के रूप में अगुणितों (haploids) के लाभ उनके निम्नलिखित उपयोगिता मूल्यों (utility values) के कारण अधिक स्पष्ट हो जाते हैं:

• वे समयुग्मजता (homozygosity) प्राप्त करने का सबसे तेज़ संभव तरीका प्रदान करते हैं।
• वे अप्रभावी (recessives) को पुनर्प्राप्त करने के लिए काम कर सकते हैं।
• मोनोप्लॉइड के युग्मक (gametes) लिंकेज (linkage) अध्ययन के लिए सबसे अच्छे स्रोत के रूप में बने रहते हैं।
• क्रॉस से मोनोप्लॉइड के दोगुने उत्पाद स्थिर पुनर्संयोजक (stable recombinants) प्रदान करते हैं।
• जीनोम होमोलॉजी (genome homology) अध्ययन में मोनोप्लॉइड उपयोगी होते हैं।
• उत्परिवर्तन (mutation) अध्ययन के लिए मोनोप्लॉइड आदर्श वस्तुएं हैं।
• जीन स्थानांतरण (gene transfer) अध्ययन में मोनोप्लॉइड उपयोगी होते हैं।

उपर्युक्त लाभों को ध्यान में रखते हुए, मोनोप्लॉइड प्रेरण और पुनर्जनन को पादप प्रजनन में एक शक्तिशाली उपकरण माना जाता है। माइक्रोस्पोर से मोनोप्लॉइड उत्पादन का विवरण एंथर कल्चर अध्याय में वर्णित किया गया है। यहां चर्चा की गई है कि मोनोप्लॉइड उत्पादन के लिए भ्रूण संवर्धन तकनीक का शोषण कैसे किया जा सकता है। इस तकनीक को, जिसे लोकप्रिय रूप से बल्बोसम तकनीक (Bulbosum technique) कहलाता है, मोनोप्लॉइड के उत्पादन के लिए शोषित किया जाता है और यह मादा के रूप में Hordeum vulgare और नर के रूप में H. bulbosum के साथ एक अंतर-विशिष्ट क्रॉस (interspecific cross) बनाने पर आधारित है। H. bulbosum द्वारा H. vulgare के इस क्रॉस निषेचन में सामान्य रूप से आगे बढ़ता है। युग्मनज विकास (zygote development) के दौरान, विकासशील भ्रूण की कोशिकाओं से H. bulbosum के गुणसूत्र (chromosomes) समाप्त हो जाते हैं। भ्रूणपोष विकसित होने लगता है और फिर पतित (degenerates) हो जाता है। इस स्तर पर, भ्रूण की कोशिकाओं (embryonic cells) में केवल H. vulgare जीनोम (genome) का सेट होता है और विभाजन की खराब दर (poor rate of division) दिखाते हैं जिसके परिणामस्वरूप छोटे अगुणित भ्रूण (smaller haploid embryos) बनते हैं। थोड़े भ्रूणपोष वाले इन छोटे अगुणित भ्रूणों को विच्छेदित किया जाता है और अगुणितों के उत्पादन के लिए इन विट्रो संवर्धित किया जाता है। इन विट्रो भ्रूण संवर्धन के बाद, Hordeum vulgare के विकासशील अगुणित पौधे (haploid plantlets) पाले जाते हैं और सामान्य ग्रीन हाउस (green house) स्थितियों के तहत उगाए जाते हैं और स्थापित पौधों पर गुणसूत्र दोहरीकरण (chromosome doubling) प्रेरित होता है। इस पद्धति में मोनोप्लॉइड (अगुणित) प्रेरण की बहुत उच्च आवृत्ति (high frequencies) फेंकने का लाभ है।

बीज प्रसुप्ति पर काबू पाना (Overcoming seed dormancy)

प्रजनन में भ्रूण संवर्धन का दूसरा प्रमुख अनुप्रयोग बीज प्रसुप्ति (seed dormancy) को दूर करने के साधन के रूप में है। कुछ प्रजातियों के बीज बहुत धीरे-धीरे अंकुरित होते हैं या सामान्य परिस्थितियों में बिल्कुल भी नहीं होते हैं। कारण अंतर्जात अवरोधक (endogenous inhibitors), कम लंबाई (lesser length), उच्च तापमान (high temperature), भंडारण की स्थिति (storage condition) और भ्रूण की परिपक्वता (maturity) के रूप में हो सकता है। बीज अंकुरण के लिए विशिष्ट संकेत प्रदान करके इन समस्याओं को ठीक भ्रूण संवर्धन के माध्यम से दूर किया जा सकता है। उदाहरणों में Iris, Ilex, Viburnum, Paeonia, Brassica chinensis, Musa bulbisiana आदि शामिल हैं।

पौधों के प्रजनन चक्र को छोटा करना (Shortening breeding cycle of plants)

भ्रूण संवर्धन उन मामलों में नई किस्मों के प्रजनन चक्र (breeding cycle) को कम करने में भी उपयोगी है जहां लंबी प्रसुप्ति (dormancy) प्रजनन चक्र के विस्तार का कारण बनती है। गुलाब (rose) की खेती वाली किस्मों में आमतौर पर फूल आने में लगभग एक वर्ष और फलों के निर्माण के लिए दो से तीन महीने लगते हैं। संवर्धित भ्रूण से उत्पन्न पौधे (Seedlings) दो से तीन महीने में फूलते हैं। ये फूल आगे के क्रॉस के लिए नर मूल (male parent) के रूप में काम कर सकते हैं, इस प्रकार प्रजनक (breeder) को एक वर्ष में दो पीढ़ियों का उत्पादन करने या प्रजनन चक्र को तीन या चार महीने तक छोटा करने में सक्षम बनाते हैं। अन्य उदाहरण वीपिंग क्रैप एप्पल (weeping crap apple - Malus sp.) है जिसमें इन विट्रो संवर्धित बीज चार महीने में पौधे पैदा करते हैं। दूसरी ओर, मिट्टी में लगाए गए बीजों को अंकुरित होने में लगभग नौ महीने लगते हैं।

जीन स्थानांतरण में भ्रूण संवर्धन और बैक संकरण का संयोजन (Combining embryo culture and back crossing in gene transfer)

भ्रूण संवर्धन को कुछ पौधों के संकरों (plant hybrids) को फिर से संश्लेषित (resynthesising) करने के लिए एक जीवनक्षम तकनीक के रूप में सिद्ध किया गया है। उदाहरण के लिए Brassica napus को भ्रूण संवर्धन का उपयोग करके B. campestris / B. oleracea के क्रॉस से फिर से संश्लेषित किया गया है। हाल का दृष्टिकोण पुनः संश्लेषित B. napus (2n=38) को B. campestris (2n=20) के साथ बैक क्रॉस (back crossing) करना है, ताकि B. oleracea से जीन को B. campestris में स्थानांतरित किया जा सके। 1988 में काज़ी (Quazi) ने इस संबंध में एक प्रयास किया और सफल परिणामों के साथ सामने आए। उन्हें (B. napus / B. oleracea) / B. oleracea के बैक क्रॉस से एक लाइन (aline) मिली जो गोभी एफिड (cabbage aphid) के हमले के लिए प्रतिरोधी (resistant) है। उसी दृष्टिकोण का पालन करते हुए मिलानोवा (Milanova) और उनके सहकर्मियों (1991) ने Nicotiana africana और N. tabaccum क्रॉस से साइटोप्लाज्मिक रूप से नर बंध्य (cytoplasmically male sterile) तंबाकू पौधे (tobacco plants) तैयार किए। इस प्रकार यह योजना प्रजातियों की बाधा को दूर करते हुए जीन स्थानांतरण की सुविधा प्रदान करती है।

अन्य अनुप्रयोग (Other applications)

भ्रूण संवर्धन तकनीक को विभिन्न वृक्ष प्रजातियों (tree species) के बीज परीक्षण (seed testing), बाध्यकारी फैनरोगैमिक परजीवियों (obligate phanerogamic parasites) के बीजों को अंकुरित करने, बीज जनित रोगों (seed-borne diseases) में परपोषी-रोगजनक संबंध (host-pathogen relationship) का अध्ययन करने और विकासात्मक भ्रूणजनन (developmental embryogenesis) का अध्ययन करने में प्रभावी ढंग से संलग्न किया जा सकता है। भ्रूण संवर्धन तकनीक ने पादप प्रजनन में एक अमूल्य उपकरण के रूप में अपनी विश्वसनीयता पहले ही स्थापित कर ली है और भ्रूण संवर्धन विधि में प्रगति ने इन विट्रो संवर्धन (in vitro culture) के क्षेत्र में नए रास्ते खोलने का काम किया है। लेकिन उन मिनट की पेचीदगियों को सुलझाने के लिए अधिक ध्यान दिया जाना चाहिए जो भ्रूण संवर्धन के दोहन (exploitation) में बड़ी बाधा बनी हुई हैं।

भ्रूण बचाव (Embryo rescue)

दूर के क्रॉस (Distant crosses) कई कारणों में से एक या अधिक के कारण विफल हो सकते हैं जैसे पराग (pollen) का अंकुरित (germinate) होने में असमर्थता, पराग नलिकाओं (pollen tubes) के बढ़ने में विफलता या शायद अधिक सामान्यतः भ्रूणपोष का पतन। जब भ्रूणपोष के पतन के कारण भ्रूण विकसित होने में विफल रहता है, तो हाइब्रिड पौधों को पुनर्प्राप्त करने के लिए भ्रूण संवर्धन का उपयोग किया जाता है। इसे भ्रूण संवर्धन के माध्यम से हाइब्रिड बचाव (hybrid rescue) कहा जाता है। कुछ हालिया उदाहरण Hordium vulgare X Secale cereale, Triticum aestivum X Agropyron repens, H. vulgare X Triticum aestivum आदि से संकरों की रिकवरी हैं। ट्रिटिकेल (Triticale) के मामले में ट्रिटिकेल और Secale के बीच दुर्लभ संयोजन जीवनक्षम बीज (viable seeds) विकसित करते हैं। लेकिन अधिकांश टेट्राप्लोइड (tetraploid) और हेक्साप्लोइड (hexaploid) गेहूं में दो प्रमुख जीन (dominant genes), Kr1 और Kr2 होते हैं, जो Secale के साथ क्रॉस में बीज के विकास को रोकते हैं। अधिकांश संकर बीज छोटे होते हैं, खराब विकसित होते हैं और बहुत खराब अंकुरण (germination) दिखाते हैं। इसके अलावा, परागित फूलों (pollinated florets) के केवल 5-10% से बीज प्राप्त किए जाते हैं। हाइब्रिड पौधों की रिकवरी बहुत अधिक (50-70%) होती है जब 10-14 दिन पुराने कैरियोप्स (caryopses) से भ्रूण को हटा दिया जाता है और एक उपयुक्त माध्यम पर संवर्धित किया जाता है।

बल्बोसम तकनीक

सिद्धांत (Principle)

निषेचन H. vulgare और H. bulbosum के बीच आसानी से आगे बढ़ता है। युग्मनज प्रेरण (Zygote induction) उच्च है और विकासशील भ्रूण की कोशिकाओं से H. bulbosum के गुणसूत्र तेजी से समाप्त (eliminated) हो जाते हैं। यह दो से पांच दिनों तक विकसित होता है और फिर गर्भपात (aborts) हो जाता है। विकासशील मोनोप्लॉइड भ्रूण कोशिकाओं में, विभाजन और वृद्धि द्विगुणित कोशिकाओं (diploid cells) की तुलना में धीमी होती है। मोनोप्लॉइड स्थिति की यह तुलनात्मक रूप से धीमी वृद्धि, भ्रूणपोष के विघटन के साथ मिलकर छोटे भ्रूणों के निर्माण की ओर ले जाती है जिन्हें फलों से काट कर निकाला जाता है और उनके विकास को पूरा करने के लिए इन विट्रो पोषक तत्व प्रदान किए जाते हैं। इन विट्रो भ्रूण संवर्धन के बाद, विकासशील पौधों को सामान्य ग्रीन हाउस स्थितियों के तहत उठाया जाता है और स्थापित पौधों पर गुणसूत्र दोहरीकरण प्रेरित होता है।

लाभ

• गुणसूत्र उन्मूलन (chromosome elimination) के बाद संकरण (hybridization) की विधि Hordeum की अन्य प्रजातियों और हेक्साप्लोइड गेहूं (hexaploid wheat) में भी अगुणित उत्पादन (haploid production) के लिए सामान्य रुचि का साबित होती है।
• नर के रूप में H. vulgare और मादा के रूप में H. bulbosum का उपयोग करके H. bulbosum के साइटोप्लाज्म (cytoplasm) में जौ के मोनोप्लॉइड (monoploids) का उत्पादन करना संभव है। वाहन के रूप में भ्रूण संवर्धन का उपयोग करते हुए, उच्च आवृत्ति विदेशी साइटोप्लाज्म मोनोप्लॉइड (foreign cytoplasm monoploids) प्राप्त किए जा सकते हैं।
• Hordeum प्रजाति केवल एक ही नहीं है जहाँ उच्च पौधों में गुणसूत्र उन्मूलन पाया जाता है। Haplopoppus में, केवल दो गुणसूत्रों वाले मोनोप्लॉइड की जांच की गई है। दैहिक गुणसूत्र उन्मूलन (somatic chromosome elimination) के माध्यम से जौ के मोनोप्लॉइड को प्रेरित करने के लिए H. bulbosum को H. vulgare के लिए आदर्श भागीदार होने की आवश्यकता नहीं है। Hordeum की एक श्रृंखला हो सकती है जिसे H. bulbosum की तुलना में अधिक कुशल प्रतिरूप के रूप में आज़माया जा सकता है।

प्रश्न (Questions)

1. भ्रूण संवर्धन का उपयोग किया जाता है …………
   1. भ्रूण गर्भपात को दूर करने के लिए (To overcome embryo abortion)
   2. बीज प्रसुप्ति को दूर करने के लिए (To overcome seed dormancy)
   3. दूर संकरण में भ्रूण बचाव (Embryo rescue in distant hybridization)
   4. उपरोक्त सभी (All the above)
2. अंडाशय संवर्धन पहली बार किसके द्वारा रिपोर्ट किया गया था …………
   1. Northern
   2. San Noem
   3. Kano
   4. None of the above
3. अंडाशय संवर्धन पहली बार किसमें रिपोर्ट किया गया था …………
   1. जौ
   2. ज्वार (Sorghum)
   3. कपास (Cotton)
   4. None of the above
4. भ्रूण संवर्धन पहली बार किसमें रिपोर्ट किया गया था …………
   1. मूली
   2. ज्वार
   3. कपास
   4. None of the above
5. भ्रूण संवर्धन पहली बार किसके द्वारा रिपोर्ट किया गया था …………
   1. Hanning
   2. San Noem
   3. Kano
   4. None of the above
6. भ्रूण संवर्धन की सफलता किस पर निर्भर करती है …………
   1. अलगाव के समय भ्रूण का विकासात्मक चरण
   2. मातृ पौधे की वृद्धि की स्थिति
   3. पोषक माध्यम की संरचना (Composition of the nutrient medium)
   4. उपरोक्त सभी
7. भ्रूण संवर्धन माध्यम में उपयोग नहीं किया जाने वाला वृद्धि हार्मोन है …………
   1. ऑक्सिन
   2. जिबरेलिन (Gibberellin)
   3. साइटोकाइनिन (Cytokinin)
   4. None of the above
8. भ्रूण प्रत्यारोपण तकनीक किसके द्वारा प्रस्तावित की गई थी …………
   1. Pissarev
   2. Vinogradova
   3. Both a & b
   4. Kruse
9. भ्रूण संवर्धन का उपयोग किसके लिए किया जाता है …………
   1. भ्रूण बचाव
   2. मोनोप्लॉइड उत्पादन
   3. बीज प्रसुप्ति को दूर करने के लिए
   4. उपरोक्त सभी
10. बल्बोसम तकनीक का उपयोग किसके लिए किया जाता है …………
    1. भ्रूण बचाव
    2. मोनोप्लॉइड उत्पादन
    3. बीज प्रसुप्ति को दूर करने के लिए
    4. उपरोक्त सभी

अतिरिक्त पठन… (Additional readings…)

http://www.youtube.com/watch?v=m5JEZq0Fxuk&feature=related - video