यूकेरियोट्स (Eukaryotes) में आनुवंशिक सामग्री (genetic material) का एक जीव से दूसरे जीव में स्थानांतरण पारंपरिक रूप से लैंगिक जनन (sexual breeding) के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। पौधों में, जहाँ काफी दूर की प्रजातियों को पार (crossed) किया जा सकता है, यौन असंगति बाधाओं (sexual incompatibility barriers) के कारण वांछित व्यक्तियों के बीच पूर्ण संकर (full hybrids) प्राप्त करना हमेशा संभव नहीं रहा है। इस संबंध में कोशिका संलयन (cell fusion) दैहिक संकरण (somatic hybridization) के माध्यम से दूरस्थ संकरण (distant hybridization) के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करता है। कोशिकाओं का संलयन प्लाज्मा झिल्ली (plasma membrane) के माध्यम से होना चाहिए। जानवरों के विपरीत, पौधों में प्लाज्मा झिल्ली एक कठोर सेलुलोसिक दीवार (cellulosic wall) से घिरी होती है और आसन्न कोशिकाएं (adjacent cells) एक पेक्टिन (pectin) समृद्ध मैट्रिक्स द्वारा एक साथ चिपकी होती हैं। यही कारण है कि दैहिक कोशिका आनुवंशिकी (somatic cell genetics) पौधों की तुलना में जानवरों में अधिक उन्नत है। 1960 में, ई. सी. कॉकिंग (E. C. Cocking) ने बड़ी मात्रा में जीवनक्षम नग्न कोशिकाओं (viable naked cells) - जिन्हें प्रोटोप्लास्ट (protoplasts) कहा जाता है, प्राप्त करने के लिए पौधे की कोशिका भित्ति (plant cell walls) के एंजाइमैटिक क्षरण (enzymatic degradation) की साध्यता का प्रदर्शन किया।
एक दूसरे के साथ संलयन (fuse) करने में सक्षम होने के अलावा, उच्च पौधे के प्रोटोप्लास्ट (higher plant protoplasts) विशिष्ट रासायनिक और भौतिक उपचारों के तहत अपनी नग्न प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से विदेशी DNA (foreign DNA) भी ग्रहण कर सकते हैं। प्रोटोप्लास्ट व्यक्तिगत कोशिकाओं के विकास गुणों की जांच से लेकर झिल्ली परिवहन (membrane transport) तक जैव रासायनिक (biochemical) और आणविक अध्ययनों (molecular studies) की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक प्रयोगात्मक प्रणाली (experimental system) भी प्रदान करते हैं।
क्लेकर (Klecker) ने 1892 में पहली बार यांत्रिक साधनों द्वारा प्रोटोप्लास्ट अलगाव शुरू किया था - कोशिकाओं को एक उपयुक्त माध्यम प्लास्मोलाइटिकम (plasmolyticum) में रखा गया था और एक महीन चाकू से काटा गया था। इस प्रक्रिया में कुछ प्लाज्मोलाइज्ड कोशिकाओं (plasmolyzed cells) को केवल कोशिका भित्ति के माध्यम से काटा गया, जिससे अक्षुण्ण प्रोटोप्लास्ट (intact protoplasts) मुक्त हो गए।
यांत्रिक विधि का सिद्धांत (Principle of Mechanical Method): जब ऊतक (tissue) को एक रेजर ब्लेड (razor blade) के साथ बिंदीदार रेखा (dotted line) के साथ काटा जाता है, तो कुछ प्रोटोप्लास्ट मुक्त हो जाएंगे।
A. ऊतक को बिंदीदार रेखा के साथ काटा जाता है
B. क्षतिग्रस्त कोशिकाओं (Damaged cells) से प्रोटोप्लास्ट का विमोचन (Release)
सीमाएँ (Limitation):
1960 में, कॉकिंग ने कोशिका भित्ति को नीचा दिखाने (degrade) के लिए कवक (fungus), Myrothecium verrucaria के कल्चर (cultures) से तैयार सेल्युलेज एंजाइम (cellulase enzyme) के एक केंद्रित समाधान (concentrated solution) का उपयोग किया।
हालांकि, इस क्षेत्र में वास्तविक प्रगति 1968 के बाद हुई जब सेल्युलेज (cellulase) और मैसेरोजाइम (macerozyme) एंजाइम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो गए। प्रोटोप्लास्ट अलगाव के लिए एंजाइमों की व्यावसायिक तैयारियों को पहली बार टेकेबे और अन्य (Takebe et al., 1968) द्वारा नियोजित किया गया था। तंबाकू के पत्ते (tobacco leaf) की प्रजातियों को पहले एकल कोशिकाओं (single cells) को मुक्त करने के लिए मैसेरोजाइम के संपर्क में लाया गया था, जिन्हें फिर कोशिका भित्ति को पचाने (digest) और प्रोटोप्लास्ट को मुक्त करने के लिए सेल्युलेज के साथ इलाज किया गया था। बाद में, इन दोनों एंजाइमों का एक साथ उपयोग किया गया और इसे एक तेज़ विधि (faster method) के रूप में पाया गया और यह कुछ चरणों को कम करके माइक्रोबियल संदूषण (microbial contamination) की संभावना को भी कम करता है।
एपिडर्मिस छीलकर पत्तियों का उपयोग करके मेसोफिल प्रोटोप्लास्ट का अलगाव (Isolation of Mesophyll Protoplasts Using Leaves with Epidermis Peeled Off)
1. पत्तियां (Leaves)
2. पत्तियों का नसबंदी (Sterilization of leaves)
3. छीलकर एपिडर्मिस को हटाना (Removal of epidermis by peeling)
4. एंजाइम विलयन में छीले गए पत्ते (Peeled leaves in enzyme solution)
5. एंजाइम विलयन में मुक्त प्रोटोप्लास्ट (Released protoplasts in enzyme solution)
6. धुलाई माध्यम में प्रोटोप्लास्ट (Protoplasts in washing medium)
7. सेंट्रीफ्यूजेशन (Centrifugation)
8. कोशिका मलबा (Cell debris)
9. प्रोटोप्लास्ट
10. पृथक प्रोटोप्लास्ट (Isolated protoplasts)
तालिका: प्रोटोप्लास्ट अलगाव के लिए कुछ आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंजाइम (Table: Some commonly used commercially available enzymes for protoplast isolation)
| एंजाइम (Enzymes) | स्रोत (Source) |
|---|---|
| Cellulases | |
| Onozuka RS | Trichoderma viride |
| Cellulase R-10 | T. viride |
| Hemicellulase | |
| Hemicellulase | Aspergillus niger |
| Rhozyme HP150 | A. niger |
| Pectinase | |
| Macerozyme R-10 | Rhizopus spp. |
| Macerase | Rhizopus spp. |
व्यावसायिक रूप से अब एंजाइम तैयारियों की एक श्रृंखला उपलब्ध है और ऊतक की प्रकृति (nature of the tissue) के आधार पर इनका विभिन्न संयोजनों में उपयोग किया जाता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंजाइमों के उपयोग ने लगभग हर पौधे के ऊतकों से प्रोटोप्लास्ट के अलगाव को सक्षम किया है जब तक कि कोशिकाओं ने लिग्निफिकेशन (lignification) हासिल नहीं किया है। इन विवो (in vivo) और इन विट्रो (in vitro) में उगने वाले पौधे, एसेप्टिक सीडलिंग्स (aseptic seedlings), माइक्रोस्पोर मदर सेल्स (microspore mother cells), युवा माइक्रोस्पोर्स (young microspores), पराग कण कैली (pollen grain calli) और भ्रूणजन्य और गैर-भ्रूणजन्य निलंबन संवर्धनयों (embryogenic and non-embryogenic suspension cultures) की मेसोफिल कोशिकाओं (mesophyll cells) से प्रोटोप्लास्ट अलगाव की सूचना मिली है। हाल ही में, नर और मादा युग्मकों (male and female gametes) से जीवनक्षम प्रोटोप्लास्ट प्राप्त किए गए हैं।
प्रत्यक्ष विधि (Direct method) - एक चरण विधि (one step method) में, पत्ती के खंडों (leaf segments) को रात भर (15-18h) 25°C पर एंजाइम मिश्रण के साथ ऊष्मायन (incubated) किया जाता है और प्रोटोप्लास्ट को मुक्त करने के लिए धीरे से छेड़ा (teased) जाता है। मिश्रण को पत्ती के मलबे (leaf debris) को हटाने के लिए महीन तार की जाली (fine wire gauze) के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है, 13 × 1000 मिमी स्क्रू कैप वाले ट्यूबों (screw capped tubes) में स्थानांतरित किया जाता है और 1 मिनट के लिए 100g पर सेंट्रीफ्यूज (centrifuged) किया जाता है।
प्रोटोप्लास्ट एक गोली (pellet) बनाते हैं और सतह पर तैरनेवाला (supernatant) हटा दिया जाता है। यह प्रक्रिया तीन बार दोहराई जाती है और प्रोटोप्लास्ट को 13% सोर्बिटोल समाधान (Sorbitol solution) से धोया जाता है, जिसे बाद में 20% सुक्रोज समाधान (sucrose solution) से बदल दिया जाता है। प्रोटोप्लास्ट निलंबन (protoplasts suspension) को 1 मिनट के लिए 200g की गति से सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। साफ किए गए प्रोटोप्लास्ट, जो तैर रहे हैं (मलबा नीचे बैठ जाता है), उन्हें पिपेट (pipetted out) करके थोक (bulked) किया जा सकता है।
अनुक्रमिक विधि (Sequential method) - दो चरण विधि (two step method) में, पत्ती के खंड मिश्रण A (0.5% macerozyme + 0.3% potassium dextran sulphate 13% mannitol में pH 5.8 पर) के साथ 5 मिनट के लिए वैक्यूम घुसपैठ (vacuum infiltrated) किए जाते हैं; 25°C पर पानी के स्नान (water bath) में स्थानांतरित किए जाते हैं और धीमी गति से हिलाए (slow shaking) जाते हैं।
15 मिनट के बाद एंजाइम मिश्रण को ताजा 'एंजाइम मिश्रण A' (enzyme mixture A) द्वारा बदल दिया जाता है और पत्ती के खंडों को एक और घंटे के लिए ऊष्मायन किया जाता है। पृथक कोशिकाओं (isolated cells) का शुद्ध नमूना प्राप्त करने के लिए मिश्रण को नायलॉन जाल (nylon mesh) का उपयोग करके फ़िल्टर किया जाता है, 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज (100g) किया जाता है और 13% मैनिटोल (mannitol) के साथ तीन बार धोया जाता है।
फिर इन कोशिकाओं को 'एंजाइम मिश्रण B' (2% cellulase 13% mannitol के घोल में pH 5.4 पर) के साथ 30°C पर 90 मिनट से अधिक समय तक ऊष्मायन किया जाता है। ऊष्मायन के बाद, मिश्रण को 1 मिनट के लिए 100g पर सेंट्रीफ्यूज किया जाता है, ताकि प्रोटोप्लास्ट एक गोली बना लें, जिसे ऊपर 'एक चरण विधि' की तरह तीन बार साफ किया जाता है।
पत्ती पौधे के प्रोटोप्लास्ट का सबसे पसंदीदा स्रोत (favorite source) रहा है क्योंकि यह पौधों को मारने की आवश्यकता के बिना बड़ी संख्या में अपेक्षाकृत समान कोशिकाओं (uniform cells) के अलगाव की अनुमति देता है। चूंकि मेसोफिल कोशिका (mesophyll cell) ढीले ढंग से व्यवस्थित होती है, इसलिए एंजाइमों की कोशिका भित्ति तक आसान पहुंच होती है। इन विट्रो जड़ों या टहनियों (shoots) की पत्तियों ने खेत में उगाई गई सामग्री की पत्तियों की तुलना में दोगुनी जीवनक्षम (viable) प्रोटोप्लास्ट जारी किए। अनाज (cereals) और अन्य प्रजातियों की पत्ती कोशिकाओं से सुसंस्कृत प्रोटोप्लास्ट (culturable protoplasts) को अलग करने में कठिनाई के कारण, उनकी संवर्धित कोशिकाओं (cultured cells) का उपयोग वैकल्पिक स्रोत सामग्री (alternative source material) के रूप में किया गया है।
निचली एपिडर्मिस (lower epidermis) को छील दिया जाता है और पत्ती के छिलके वाले टुकड़ों को एंजाइम पर इस तरह तैराया जाता है कि छिलके वाली सतह (peeled surface) विलयन (solution) के संपर्क में रहे। यह पत्ती के अंतरकोशिकीय स्थानों (intercellular spaces) में एंजाइम के आसान प्रवेश की सुविधा प्रदान करेगा। एंजाइम समाधान के साथ पत्ती के टुकड़ों को आंशिक वैक्यूम (partial vacuum) के तहत 3-5 मिनट तक घुसपैठ करके अनाज के मेसोफिल प्रोटोप्लास्ट (Mesophyll protoplasts) को 2 घंटे के भीतर अलग किया जा सकता है। पर्याप्त घुसपैठ की जांच के लिए उपयोग किया जाने वाला मानदंड यह है कि वैक्यूम हटा दिए जाने पर पत्ती के टुकड़े डूब जाएंगे। एक नरम ब्रश या स्केलपेल (scalpel) के काटने वाले किनारे से पत्ती को ब्रश करने से एंजाइमैटिक क्रिया (enzymatic action) में सुधार हो सकता है।
पौधों की कोशिकाओं से प्रोटोप्लास्ट को अलग करने के लिए आवश्यक दो एंजाइम सेल्युलेज और पेक्टिनेज (pectinase) हैं। पेक्टिनेज मुख्य रूप से मध्य पटल (middle lamella) को क्षीण करता है और सेलुलोसिक कोशिका भित्ति को पचाने के लिए सेल्युलेज की आवश्यकता होती है। कच्चे वाणिज्यिक एंजाइम (crude commercial enzymes) न्यूक्लिज (nucleases) और प्रोटीज (proteases) को अशुद्धियों के रूप में ले जाते हैं जो प्रोटोप्लास्ट जीवनक्षमता (viability) के लिए हानिकारक हो सकते हैं। एंजाइमों की गतिविधि pH पर निर्भर है और यह तापमान (temperature) से भी प्रभावित होती है। इन एंजाइमों की गतिविधि के लिए इष्टतम तापमान 40-50°C है जो कोशिकाओं के लिए बहुत अधिक होता है। आम तौर पर प्रोटोप्लास्ट के अलगाव के लिए 25-30°C पर्याप्त पाया जाता है।
पृथक प्रोटोप्लास्ट का एक मौलिक गुण (fundamental property) उनकी आसमाटिक नाजुकता (osmotic fragility) है और इसलिए, एंजाइम समाधान, प्रोटोप्लास्ट माध्यम और प्रोटोप्लास्ट कल्चर माध्यम में एक उपयुक्त आसमाटिक स्टेबलाइजर (osmotic stabilizer) की आवश्यकता होती है। आइसोटोनिक (isotonic) घोल की तुलना में थोड़ा हाइपरटोनिक (hypertonic) घोल में प्रोटोप्लास्ट अधिक स्थिर होते हैं। ऑस्मोटिकम का उच्च स्तर फटने (bursting) और नवोदित (budding) होने से रोक सकता है लेकिन यह प्रोटोप्लास्ट के विभाजन (division) को रोक सकता है। 450-800 mmol की सीमा में सोर्बिटोल (sorbitol) और मैनिटोल का सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।
प्रोटोप्लास्ट कल्चर के लिए उपयोग की जाने वाली विधियाँ मूल रूप से वही हैं जो अन्य ऊतक और सेल कल्चर (cell culture) के लिए नियोजित हैं। विशेष आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए तरल (liquid) या ठोस (solid) अगर (agar) मीडिया पर प्रोटोप्लास्ट का संवर्धन किया जा सकता है। निम्नलिखित खंड में, उपलब्ध संवर्धन विधियों की एक विस्तृत श्रृंखला का वर्णन किया गया है।
तरल कल्चर (Liquid cultures)
प्रोटोप्लास्ट को उचित घनत्व (density) पर तरल संवर्धन माध्यम की एक छोटी मात्रा में निलंबित (suspended) किया जाता है और पेट्री डिश (petri dishes) में रखा जाता है, जिन्हें बाद में संवर्धन माध्यम से पानी के नुकसान को कम करने के लिए पैराफिल्म (parafilm) से सील कर दिया जाता है। तरल संवर्धन का लाभ यह है कि यह संवर्धन माध्यम की परासरणता (osmolarity) में क्रमिक परिवर्तन की अनुमति देता है और इस तरह तेजी से कोशिका पुनर्जनन (cell regeneration) को बढ़ावा देता है। इस विधि के लिए प्रोटोप्लास्ट निलंबन (protoplast suspension) की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है। यदि प्रोटोप्लास्ट की छोटी मात्रा का संवर्धन किया जाना है, तो निम्नलिखित में से कोई एक तरीका अपनाया जा सकता है।
ड्रॉप कल्चर (Drop cultures)
प्रोटोप्लास्ट निलंबन की छोटी बूंदें (40 से 100 ul) पेट्री डिश के ढक्कन के भीतरी हिस्से पर रखी जाती हैं। जब ढक्कन को निचले डिश पर ढक दिया जाता है, तो संवर्धन की बूंदें (culture drops) नीचे की डिश की ओर बदल जाती हैं। आवश्यकता पड़ने पर छोटी बूंदों में डिश में ताजा माध्यम (fresh medium) जोड़ा जा सकता है.
माइक्रोचैम्बर कल्चर (Microchamber cultures)
माइक्रोचैम्बर कल्चर हैंगिंग ड्रॉप कल्चर (hanging drop cultures) के समान हैं और व्यक्तिगत प्रोटोप्लास्ट कल्चर के लिए अपनाए जाते हैं। प्रोटोप्लास्ट निलंबन की एक बूंद बाँझ कवर ग्लास (sterile cover glass) पर रखी जाती है और माइक्रोचैम्बर (microchamber) के साथ स्लाइड पर उल्टी (inverted) कर दी जाती है। माइक्रोचैम्बर कल्चर एक वैकल्पिक रूप से बेहतर दृश्य (better view) प्रदान करता है क्योंकि चैम्बर की गहराई न्यूनतम रखी जाती है।
मल्टीपल ड्रॉप एरे तकनीक (Multiple drop array technique)
ड्रॉप कल्चर तकनीक में, पेट्री डिश पर पांच से दस अपेक्षाकृत बड़ी बूंदें रखी जाती हैं। मल्टीपल ड्रॉप एरे तकनीक में, ड्रॉप को घटाकर 40 ml कर दिया जाता है ताकि एक पेट्री डिश में 50 बूंदें रखी जा सकें। इस विधि का उपयोग पोषण (nutritional) और हार्मोनल कारकों (hormonal factors) की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच (screen) करने के लिए किया जाता है।
माइक्रोड्रोपलेट कल्चर (Microdroplet cultures)
माइक्रोड्रोपलेट कल्चर का उपयोग व्यक्तिगत प्रोटोप्लास्ट (individual protoplasts) को सुसंस्कृत करने के लिए किया जाता है। इस तकनीक के लिए, बूंदों का आकार 0.25 से 0.50 ml तक कम कर दिया जाता है ताकि प्रत्येक बूंद में केवल एक प्रोटोप्लास्ट हो और विशेष कप या पेट्री डिश का उपयोग किया जाता है।
गेलिंग एजेंट के रूप में अगर (Agar as gelling agent)
प्रोटोप्लास्ट निलंबन को लगभग 43 से 45°C पर रखे पिघले हुए अगर माध्यम के बराबर मात्रा के साथ मिलाया जाता है। वास्तव में अगर प्लेटिंग तकनीक (agar plating technique) मूल रूप से सेल निलंबन संवर्धनयों (cell suspension cultures) के प्लेटिंग के लिए उपयोग की गई थी और बाद में विधि को संशोधित किया गया और प्रोटोप्लास्ट कल्चर पर लागू किया गया।
गेलिंग एजेंट के रूप में एगरोस या एल्गिनेट (Agarose or Alginate as gelling agent)
अगर की बजाय एगरोस (agarose) के साथ मीडिया का जमना प्रोटोप्लास्ट कल्चर दक्षता (efficiency) में सुधार करता है। एगरोस की बेहतर दक्षता दूषित पदार्थों (contaminating substances) की अनुपस्थिति और तटस्थता (neutrality) के कारण हो सकती है। प्रोटोप्लास्ट को पेट्री डिश में पहले से डाले गए और जमे हुए मीडिया के ऊपर एगरोस की पतली परतों (thin layers) में प्लेट किया जाता है।
जेल एम्बेडेड प्रोटोप्लास्ट कल्चर (Gel embedded protoplast cultures)
प्लेटिंग से पहले प्रोटोप्लास्ट को पूरे माध्यम में शामिल (incorporated) किया जाता है। प्रोटोप्लास्ट के साथ जेल अगर या एगरोस को फिर कई ब्लॉकों में काटा जाता है, जिन्हें तरल संवर्धन माध्यम की बड़ी मात्रा में स्थानांतरित किया जाता है और शेकर (shaker) पर रखा जाता है।
तरलीकरण के लिए अर्ध-ठोस मीडिया (Semi-solid media for liquification)
अगर या एगरोस के तैयार अर्ध-ठोस मीडिया (Semi-solid media) का आमतौर पर उपयोग किया जाता है। इस प्रकार के कल्चर में, प्रोटोप्लास्ट को अर्ध-ठोस मीडिया पर चढ़ाया (plated) जाता है। आगे के गुणन (multiplication) के लिए प्रोटोप्लास्ट को पुनः प्राप्त करने के लिए प्रोटोप्लास्ट के साथ अर्ध-ठोस मीडिया को 1 या 2 घंटे के लिए 40°C पर फिर से पिघलाया (remelted) जाता है।
प्रोटोप्लास्ट कल्चर में, न्यूनतम-प्लेटिंग घनत्व (minimum-plating density - mpd) एक महत्वपूर्ण कारक है। निम्नलिखित तकनीकों का उपयोग करके mpd को निम्न स्तर पर बनाए रखा जा सकता है।
फीडर परतें (Feeder layers)
विभिन्न प्रजातियों के प्रोटोप्लास्ट का एक परत मिश्रण अगर-ठोस माध्यम (agar-solidified medium) पर चढ़ाया जाता है। प्रोटोप्लास्ट को निष्क्रिय (inactivate) करने के लिए विकिरण (irradiation) के अधीन किया जाता है लेकिन प्रोटोप्लास्ट की परत को नहीं मारता है। इस परत को फीडर परत (feeder layer) कहा जाता है। फिर सुसंस्कृत किए जाने वाले प्रोटोप्लास्ट को 5 - 50 प्रोटोप्लास्ट/cm³ के कम घनत्व पर चढ़ाया जा सकता है।
नर्स कल्चर (Nurse cultures)
नर्स कल्चर तकनीक में, एक माध्यम पर उगाए गए एक या अधिक प्रजातियों के प्रोटोप्लास्ट अन्य प्रजातियों के विकास का समर्थन करते हैं यानी, एक स्थापित प्रोटोप्लास्ट संवर्धन (established protoplast culture) पर प्रोटोप्लास्ट की खेती की जा सकती है। आम तौर पर इसका पालन दो अलग-अलग प्रोटोप्लास्ट के संलयन उत्पादों (fusion products) को संवर्धित करने के लिए किया जाता है।
जलाशय मीडिया (Reservoir media)
क्वाड्रेट प्लेटों (quadrate plates) में प्रोटोप्लास्ट संवर्धित किए जाते हैं। तरल माध्यम को दो क्वाड्रेट में और प्रोटोप्लास्ट निलंबन को प्लेट के अन्य दो क्वाड्रेट में रखा जाता है। माध्यम का निरंतर रिसाव प्रोटोप्लास्ट की जीवनक्षमता को बनाए रखता है।
फ़िल्टर पेपर डिस्क का उपयोग (Use of filter paper discs)
एक अगर माध्यम पर एक फिल्टर पेपर डिस्क (filter paper disc) रखी जाती है जिसके ऊपर प्रोटोप्लास्ट निलंबन डाला जाता है। फिल्टर पेपर प्रोटोप्लास्ट को भौतिक सहायता (physical support) प्रदान करता है और अवांछित विषाक्त पदार्थों (unwanted toxic substances) को अवशोषित करता है।
पर्याप्त अवधि के लिए सामग्री को एंजाइम समाधान में ऊष्मायन करने के बाद, मूल ऊतक (original tissue) में रखे गए प्रोटोप्लास्ट को मुक्त करने के लिए ऊष्मायन पोत (incubation vessel) को धीरे से घुमाया (swirled) जाता है या पत्ती के टुकड़ों को धीरे से निचोड़ा (squeezed) जाता है। पाचन मिश्रण (digestion mixture) में अक्षुण्ण (intact) और स्वस्थ प्रोटोप्लास्ट के अलावा उपकोशिकीय मलबा (sub cellular debris), विशेष रूप से क्लोरोप्लास्ट (chloroplasts), संवहनी तत्व (vascular elements), अपचित कोशिकाएं (undigested cells) और टूटे हुए प्रोटोप्लास्ट होते हैं। ऊपर बताए गए अलग किए गए प्रोटोप्लास्ट सेल मलबे और टूटे हुए सेल ऑर्गेनेल (cell organelles) की एक श्रृंखला के साथ मीडिया में मौजूद होते हैं। इस मिश्रण से प्रोटोप्लास्ट के शुद्धिकरण के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं। केवल दो आमतौर पर उपयोग की जाने वाली विधियों का संक्षेप में वर्णन किया गया है।
अवसादन और धुलाई (Sedimentation and washing)
इस विधि में, कच्चे (crude) प्रोटोप्लास्ट निलंबन को कम गति (5 मिनट के लिए 50-100g) पर सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। अक्षुण्ण प्रोटोप्लास्ट एक गोली बनाते हैं और सेल मलबे वाले सतह पर तैरनेवाला को पिपेट (pipetted off) किया जा सकता है। गोली को धीरे से ताजा कल्चर मीडिया (fresh culture media) प्लस मैनिटोल में फिर से निलंबित (resuspended) किया जाता है और फिर से धोया जाता है। अपेक्षाकृत साफ प्रोटोप्लास्ट तैयारी (protoplast preparation) प्राप्त करने के लिए इस प्रक्रिया को दो या तीन बार दोहराया जाता है। बार-बार सौम्य पेलेटिंग (gentle pelleting) और पुनर्निलंबन (resuspension) द्वारा प्रोटोप्लास्ट को शुद्ध किया जा सकता है।
प्लवनशीलता (Flotation)
प्रोटोप्लास्ट अन्य कोशिका मलबे की तुलना में हल्के (low density) होते हैं, ढाल (gradients) का उपयोग किया जा सकता है, जो प्रोटोप्लास्ट को तैरने (float) और कोशिका मलबे को अवसाद (sediment) करने की अनुमति देगा।
मैनिटोल, सोर्बिटोल और सुक्रोज (0.3-0.6M) के एक केंद्रित समाधान को एक ढाल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और कच्चे प्रोटोप्लास्ट निलंबन को उपयुक्त गति से इस ढाल में सेंट्रीफ्यूज किया जा सकता है। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद ट्यूब के ऊपर से प्रोटोप्लास्ट को पिपेट किया जा सकता है।
यह विधि 'अवसादन और धुलाई' विधि की तुलना में बहुत कम नुकसान का कारण बनती है। Babcock बोतल (Babcock bottle) का उपयोग प्लवनशीलता के लिए भी किया जाता है, क्योंकि यह प्रोटोप्लास्ट को हटाने की सुविधा देता है।
Babcock बोतल में प्रोटोप्लास्ट का प्लवनशीलता सुक्रोज कुशन (sucrose cushion) से शुद्ध प्रोटोप्लास्ट को हटाने में बहुत आसानी करता है।
1. प्रोटोप्लास्ट, 2. बैबकॉक बोतल, 3. प्लवनशीलता कुशन (Flotation cushion)
ताज़ा पृथक किए गए प्रोटोप्लास्ट की जीवनक्षमता की जाँच कई तरीकों से की जा सकती है:
प्रोटोप्लास्ट को अगर प्लेटों (agar plates) में संवर्धित किया जा सकता है। अर्ध-ठोस माध्यम का उपयोग करने का एक फायदा यह है कि प्रोटोप्लास्ट स्थिर (stationary) रहते हैं जो विशिष्ट व्यक्तियों (specific individuals) के विकास का पालन करना सुविधाजनक बनाता है। हालाँकि, निम्नलिखित कारणों से तरल माध्यम (liquid medium) को आम तौर पर पसंद किया गया है:
प्रोटोप्लास्ट निलंबन को पेट्रीप्लेट में एक पतली परत (thin layer) के रूप में चढ़ाया जाता है, या फ्लास्क में स्थिर संवर्धनयों (static cultures) के रूप में ऊष्मायन किया जाता है या पेट्री प्लेटों में 50-100 μl बूंदों में वितरित किया जाता है और एक आर्द्र कक्ष (humidified chamber) में संग्रहीत किया जाता है। एगरोस मोतियों (agarose beads) या डिस्क (discs) में प्रोटोप्लास्ट को एम्बेड करने से कई प्रजातियों में प्लेटिंग और पुनर्जनन दक्षता (regeneration efficiency) में सुधार होने की सूचना है। एल्गिनेट (Alginate) एक अन्य गेलिंग एजेंट है जिसका उपयोग प्रोटोप्लास्ट के संवर्धन के लिए किया जाता है, विशेष रूप से उन प्रजातियों की, जो Arabidopsis thaliana जैसी गर्मी के प्रति संवेदनशील (heat sensitive) हैं। संवर्धन में 2-4 दिनों के बाद, प्रोटोप्लास्ट अपना विशिष्ट गोलाकार आकार (spherical shape) खो देते हैं और इसे नए दीवार पुनर्जनन (wall regeneration) के संकेत के रूप में लिया गया है। जबकि नियमित विभाजन (regular division) के लिए एक उचित दीवार की उपस्थिति आवश्यक है, प्रोटोप्लास्ट से पुनर्जीवित (regenerated) ऐसी सभी कोशिकाएं विभाजन पर नहीं लगती हैं। प्रोटोप्लास्ट संवर्धनयों में, कोशिका विभाजन (cell divisions) अतुल्यकालिक (asynchronous) होते हैं। पहला विभाजन समान (equal) या असमान (unequal) हो सकता है। समसूत्री विभाजन (Mitosis) सामान्य है। निरंतर कोशिका विभाजन से कैलस (callus) का निर्माण होता है और पौधे को सामान्य विकासात्मक प्रक्रिया (normal developmental process) के माध्यम से पुनर्जीवित किया जाएगा।
प्रोटोप्लास्ट, इस प्रकार सुसंस्कृत होकर पौधे (plantlets) पैदा करने के लिए निम्नलिखित प्रक्रियाओं से गुजरते हैं। वे हैं:
कल्चर में प्रोटोप्लास्ट कुछ ही घंटों में कोशिका भित्ति (cell wall) को पुनर्जीवित (regenerate) करना शुरू कर देते हैं, और इसे पूरा करने में दो से कई दिन लग सकते हैं। कल्चर में 2-4 दिनों के भीतर, प्रोटोप्लास्ट अपना विशिष्ट गोलाकार आकार खो देते हैं और इसे नए दीवार पुनर्जनन के संकेत के रूप में लिया गया है। एंजाइम के धुलने (washed off) के तुरंत बाद प्रोटोप्लास्ट द्वारा दीवार संश्लेषण (wall synthesis) शुरू हो जाता है। कोशिका भित्ति निर्माण के दौरान, सेल्यूलोज (cellulose) प्लाज्मालेम्मा (plasmalemma) और मल्टीलेमेलर दीवार सामग्री (multilamellar wall material) के बीच या सीधे प्लाज्मालेम्मा पर जमा (deposited) होता है। एक नवगठित (freshly formed) कोशिका भित्ति ढीले ढंग से व्यवस्थित माइक्रोफाइब्रिल (loosely arranged microfibrils) से बनी होती है, जो बाद में एक विशिष्ट कोशिका भित्ति बनाने के लिए संगठित हो जाती है। प्रोटोप्लास्ट कल्चर के 10-20 मिनट बाद कोशिका भित्ति संश्लेषण शुरू कर सकते हैं या सात दिनों से अधिक की अवधि तक कोशिका भित्ति के बिना जा सकते हैं। सामान्य कोशिका भित्ति वाले प्रोटोप्लास्ट समसूत्री विभाजन से गुजरते हैं और बेटी कोशिकाओं (daughter cells) का उत्पादन करते हैं। खराब (poorly) कोशिका भित्ति वाले प्रोटोप्लास्ट सामान्य समसूत्री विभाजन से नहीं गुजरते हैं, बल्कि एक दूसरे के साथ मिलकर बहु-नाभिकीय कोशिकाएं (multinucleate cells) बनाते हैं या नवोदित होने के लिए आकार में बड़े हो जाते हैं।
आम तौर पर कोशिका भित्ति के पुनर्जनन के बाद, कोशिका के आकार में उल्लेखनीय वृद्धि (significant increase) होती है। इसके बाद पहला समसूत्री विभाजन (mitotic division) होता है। पहले विभाजन के तुरंत बाद, प्रोटोप्लास्ट एक अंतराल चरण (lag phase) से गुजर सकते हैं, जो 7-25 दिनों तक चलता है। आम तौर पर, सक्रिय रूप से बढ़ने वाले सेल निलंबन (cell suspensions) के प्रोटोप्लास्ट मेसोफिल प्रोटोप्लास्ट की तुलना में तेजी से पहले विभाजन से गुजरते हैं। विभाजन (divisions) का दूसरा दौर अक्सर पहले विभाजन के एक सप्ताह के भीतर देखा जाता है। छोटे सेल क्लंप (cell clumps) दूसरे विभाजन के दो सप्ताह के भीतर बनते हैं जिससे कैलस के छोटे टुकड़े बनते हैं.
ऊतक संवर्धनयों (tissue cultures) से पौधों के पुनर्जनन पर लागू होने वाली सामान्य तकनीकें प्रोटोप्लास्ट से प्राप्त कैलस के लिए भी अच्छी हैं। पौधों के पुनर्जनन के लिए पहले चरण में ऑर्गेनोजेनेसिस (organogenesis) या दैहिक भ्रूणजनन (somatic embryogenesis) को प्रेरित (induce) करने के लिए संतुलित फाइटोहोर्मोन (balanced phytohormones) युक्त पुनर्जनन माध्यम (regeneration medium) में कैलस का स्थानांतरण (transference) शामिल था। पृथक प्रोटोप्लास्ट से पौधों के पुनर्जनन की पहली रिपोर्ट 1971 में Takebe et al., द्वारा Nicotiana tabacum से थी। तब से इस क्षमता को प्रदर्शित करने वाली प्रजातियों की सूची लगातार बढ़ती गई है।
पृथक प्रोटोप्लास्ट की विशेषता जिसने उन्हें सुर्खियों में ला दिया है वह इन नग्न कोशिकाओं (naked cells) की अपनी उत्पत्ति के बावजूद एक दूसरे के साथ संलयन करने की क्षमता है। शरीर की कोशिकाओं (body cells) के संलयन के माध्यम से संकर उत्पादन (hybrid production) की तकनीक, पूरी तरह से सेक्स (sex) को दरकिनार करते हुए, दैहिक संकरण कहलाती है। लैंगिक जनन (sexual reproduction) के विपरीत जिसमें अंग जीनोम (organelle genomes) आमतौर पर मातृ माता-पिता (maternal parent) द्वारा योगदान किए जाते हैं, दैहिक संकरण दोनों माता-पिता (parents) से साइटोप्लाज्मिक ऑर्गेनेल (cytoplasmic organelles) को भी जोड़ती है। दैहिक संकरों (somatic hybrids) में, माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम (mitochondrial genome) का पुनर्संयोजन (recombination) अक्सर होता है। क्लोरोप्लास्ट जीनोम (Chloroplast genome) पुनर्संयोजन दुर्लभ है, लेकिन एक या दूसरे माता-पिता के क्लोरोप्लास्ट का अलगाव (segregation), उपन्यास परमाणु-साइटोप्लाज्मिक (novel nuclear-cytoplasmic) संयोजनों का निर्माण करता है। एक माता-पिता के नाभिक (nucleus) और दूसरे माता-पिता के अतिरिक्त-परमाणु जीनोम (extra-nuclear genome/s) के साथ संलयन उत्पादों को साइब्रिड (cybrid) कहा जाता है और ऐसे आनुवंशिक संयोजनों (genetic combination/s) के साथ कोशिकाओं या पौधों को प्राप्त करने की प्रक्रिया को साइब्रिडाइजेशन (cybridization) कहा जाता है।
कोशिका भित्ति (cell walls) के एंजाइमैटिक अवक्रमण के दौरान कुछ आसन्न प्रोटोप्लास्ट एक साथ जुड़कर होमोकैरियोन (homokaryones - जिन्हें होमोकैरियोट्स भी कहा जाता है, प्रत्येक में दो से कई नाभिक होते हैं) बनाते हैं। इस प्रकार के प्रोटोप्लास्ट संलयन को सहज संलयन (spontaneous fusion) कहा जाता है। प्रोटोप्लास्ट अलगाव की एक अनुक्रमिक विधि या मिश्रित एंजाइम विलयन के साथ इलाज करने से पहले कोशिकाओं को मजबूत प्लास्मोलाइटिकम विलयन में उजागर करने से प्लास्मोडेसमैटल कनेक्शन (plasmodesmatal connection) प्रभावित होगा और परिणामस्वरूप सहज संलयन की आवृत्ति (frequency) कम हो जाएगी। जहाँ तक दैहिक संकरण का संबंध है सहज संलयन का कोई मूल्य नहीं है; इनके लिए विभिन्न मूल (different origin) के प्रोटोप्लास्ट के संलयन की आवश्यकता होती है। प्रेरित संलयन (induced fusion) को प्राप्त करने के लिए, एक उपयुक्त रासायनिक एजेंट (fusogen) या विद्युत उत्तेजना (electric stimulus) आम तौर पर आवश्यक है।
1. NaNO3 उपचार (NaNO3 treatment)
NaNO3 का हाइपोटोनिक समाधान प्लाज्मोलाइज्ड एपिडर्मल कोशिकाओं (plasmolysed epidermal cells) के भीतर उप-प्रोटोप्लास्ट (sub-protoplasts) के संलयन को प्रेरित करता है। हालाँकि, यह तकनीक हेटेरोकैरियोन गठन (heterokaryon formation) की कम आवृत्ति (low frequency) से ग्रस्त है।
2. उच्च pH और उच्च Ca2+ उपचार (High pH and high Ca2+ treatment)
प्रजातियों की दो अलग-अलग लाइनों के मेसोफिल प्रोटोप्लास्ट को लगभग 30 मिनट के लिए 37°C पर उच्च Ca2+ आयनों के अत्यधिक बेसीय समाधान (pH 10.5) में इलाज करके जोड़ा जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग करके इंट्रा और इंटर स्पेसिफिक Nicotiana संकर (hybrids) विकसित किए गए थे। हालाँकि, कुछ प्रजातियों के लिए यह उच्च pH विषाक्त (toxic) हो सकता है।
3. पॉलीथीन ग्लाइकोल (PEG) उपचार (Polyethylene glycol treatment)
PEG को फुसोगेन के रूप में स्वीकार किया गया है क्योंकि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उच्च आवृत्ति (reproducible high frequency) हेटेरोकैरियोन गठन, विशेष रूप से द्विनाभिक (binucleate) गठन, और अधिकांश कोशिका प्रकारों के लिए इसकी तुलनात्मक रूप से कम साइटोटोक्सिसिटी (cytotoxicity)। PEG प्रेरित संलयन गैर-विशिष्ट (non-specific) है। सोयाबीन-मक्का और सोयाबीन-जौ (soybean-barley) को मिलाने के अलावा, PEG जानवरों की कोशिकाओं, खमीर प्रोटोप्लास्ट (yeast protoplast) के साथ पशु कोशिकाओं और उच्च पौधे के प्रोटोप्लास्ट के साथ पशु कोशिकाओं के बीच प्रभावी संलयन लाता है। चुने गए दो माता-पिता के पृथक प्रोटोप्लास्ट को उचित अनुपात में मिलाया जाता है और 15-30 मिनट के लिए 15-45% PEG (1500-6000 MW) समाधान के साथ इलाज किया जाता है, इसके बाद संवर्धन माध्यम के साथ प्रोटोप्लास्ट की क्रमिक धुलाई (gradual washing) की जाती है।
प्रोटोप्लास्ट संलयन में तीन मुख्य चरण होते हैं:
PEG-प्रेरित संलयन का वास्तविक तंत्र स्पष्ट नहीं है। स्वीकृत परिकल्पना (accepted hypothesis) यह है कि PEG अणु जो ध्रुवता (polarity) में थोड़ा नकारात्मक है, पानी, प्रोटीन, कार्बोहाइड्रेट आदि के साथ हाइड्रोजन बांड (hydrogen bonds) बना सकता है, जिनमें सकारात्मक ध्रुवीकृत समूह (positively polarized groups) होते हैं। जब PEG अणु श्रृंखला काफी बड़ी होती है तो यह आसन्न (adjacent) प्रोटोप्लास्ट की सतह के बीच एक आणविक पुल (molecular bridge) के रूप में कार्य करती है और आसंजन (adhesion) होता है। PEG Ca2+ के साथ-साथ अन्य धनायनों (cations) को भी बांध सकता है। ये कैल्शियम आयन प्रोटीन (या फॉस्फोलिपिड्स) और PEG के नकारात्मक ध्रुवीकृत समूहों के बीच एक पुल बना सकते हैं, इस प्रकार, आसंजन को बढ़ाते हैं। धुलाई प्रक्रिया के दौरान सीधे या Ca2+ के माध्यम से झिल्ली से बंधे PEG अणुओं को हटा (eluted) दिया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप विद्युत आवेश (electric charge) में गड़बड़ी और पुनर्वितरण (redistribution) होता है। झिल्ली के अंतरंग संपर्क (intimate contact) के क्षेत्रों में आवेश का ऐसा पुनर्वितरण एक प्रोटोप्लास्ट के कुछ सकारात्मक चार्ज वाले समूहों को दूसरे प्रोटोप्लास्ट के नकारात्मक चार्ज वाले समूहों से जोड़ सकता है और इसके विपरीत, जिसके परिणामस्वरूप प्रोटोप्लास्ट संलयन होता है।
इलेक्ट्रो फ्यूजन तेज (आमतौर पर 15 मिनट के भीतर पूरा होता है), सरल, सिंक्रोनस (synchronous) और अधिक आसानी से नियंत्रित होता है। यह दिखाया गया था कि Solanum tuberosum और S. brevidens के दैहिक संकरण में इलेक्ट्रोफ्यूजन PEG मध्यस्थता वाले संलयन की तुलना में अधिक प्रभावी है। ज़िम्मरमैन (Zimmermann) और अन्य (1982) ने एक विधि विकसित की, ज़िम्मरमैन इलेक्ट्रोफ्यूजन सिस्टम (Zimmermann Electrofusion System), जिसके बारे में दावा किया जाता है कि यह प्रोटोप्लास्ट संलयन के लिए किसी भी अन्य विधि की तुलना में 10000 गुना बेहतर है।
यह तकनीक मोती-श्रृंखला (pearl-chain) की तरह एक पंक्ति में प्रोटोप्लास्ट को संरेखित (align) करने के लिए कम वोल्टेज (low voltage) वाले विद्युत प्रवाह दालों (electric current pulses) का उपयोग करती है। संरेखित प्रोटोप्लास्ट को माइक्रोमैनिपुलेटर (micromanipulator) के साथ दो इलेक्ट्रोड के बीच संकीर्ण अंतराल (narrow gap) के माध्यम से कोमल गति (gentle pace) से धकेला जाता है। जब दो प्रोटोप्लास्ट जिन्हें जोड़ा जाना है, उन्हें इलेक्ट्रोड के विपरीत उचित रूप से उन्मुख (oriented) किया जाता है, तो उच्च वोल्टेज (high voltage) की एक छोटी नाड़ी जारी की जाती है जो प्रोटोप्लास्ट को फ्यूज करने के लिए प्रेरित करती है। उच्च वोल्टेज प्लाज्मालेम्मा के संगठन में क्षणिक गड़बड़ी (transient disturbances) पैदा करता है, जो पड़ोसी प्रोटोप्लास्ट के संलयन की ओर जाता है। संपूर्ण संचालक माइक्रोस्कोप के तहत इलेक्ट्रोपोरेटर (electroporator) नामक विशेष रूप से तैयार किए गए उपकरण (devised equipment) में मैन्युअल रूप से किया जाता है।
संलयन-उत्प्रेरण एजेंट (fusion-inducing agent) के साथ उपचार के बाद बरामद प्रोटोप्लास्ट निलंबन में निम्नलिखित सेल प्रकार (cell types) होते हैं:
उदा. माता-पिता (parental) के प्रोटोप्लास्ट का रंजकता (pigmentation)। एक माता-पिता का प्रोटोप्लास्ट हरा (green) और रिक्तिका (vacuolated - mesophyll cells) हो सकता है, जबकि दूसरे का गैर-रिक्तिका (non-vacuolated) और गैर-हरा (non-green - from cell cultures) हो सकता है। यदि उनमें ये विशेषताएं नहीं हैं, तो इन प्रोटोप्लास्टों को अलग-अलग फ्लोरोसेंट रंजक (fluorescent dyes) से लेबल किया जाता है। हालाँकि, यह दृष्टिकोण समय लेने वाला (time consuming) है और इसके लिए काफी कौशल और प्रयास की आवश्यकता होती है।
जो गुण (property) एक माता-पिता में मौजूद नहीं है, वह तब हासिल कर लिया जाएगा जब वे संकर अवस्था (hybrid state) में होंगे। उदाहरण के लिए, Petunia hybrida के प्रोटोप्लास्ट MS माध्यम पर कैली (calli) बनाते हैं, जबकि P. parodii के प्रोटोप्लास्ट केवल छोटी कोशिका कॉलोनियां (small cell colonies) बनाते हैं। इसके अलावा, एक्टिनोमाइसिन डी (actinomycin D) P. hybrida प्रोटोप्लास्ट के कोशिका विभाजन को रोकता है, लेकिन इसका P. parodii पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। इस प्रकार दोनों प्रजातियों के प्रोटोप्लास्ट एक्टिनोमाइसिन डी के साथ पूरक एमएस माध्यम (MS medium) पर मैक्रोस्कोपिक कॉलोनियां (macroscopic colonies) उत्पन्न करने में विफल रहते हैं। हालांकि, उनकी संकर कोशिकाएं (Petunia hybrida + P. parodii) (दैहिक संकरों को दर्शाने के लिए इस प्रतीक पर ध्यान दें) मैक्रोस्कोपिक कॉलोनियां बनाने के लिए इस माध्यम पर सामान्य रूप से विभाजित होती हैं। ये रणनीतियाँ सरल, अत्यधिक प्रभावी और सबसे कम माँग (least demanding) वाली हैं। लेकिन अधिकांश माता-पिता प्रजातियों (parental species) में उपयुक्त गुणों (suitable properties) की अनुपलब्धता से उनकी प्रयोज्यता (applicability) काफी प्रभावित होती है।
संकर कोशिकाओं के लिए बिना कोई चयन (selection) लागू किए पूरी प्रोटोप्लास्ट आबादी को सुसंस्कृत किया जाता है। कैली के लिए सभी प्रकार के प्रोटोप्लास्ट; हाइब्रिड कैली (hybrid calli) की पहचान बाद में कैलस आकृति विज्ञान (callus morphology), गुणसूत्र संविधान (chromosome constitution), प्रोटीन और एंजाइम बैंडिंग प्रतिरूप (protein and enzyme banding pattern) आदि के आधार पर की जाती है।
यौन संकरण (sexual hybridization) में प्लास्टिड (plastid) और माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम (mitochondrial genomes) का योगदान आमतौर पर केवल मादा माता-पिता (female parent) द्वारा किया जाता है, जबकि दैहिक संकरण में माता-पिता दोनों के अतिरिक्त परमाणु जीनोम (extra nuclear genomes) संयुक्त होते हैं। साइब्रिड (Cybrids) या साइटोप्लाज्मिक संकर (cytoplasmic hybrids) कोशिकाएँ या पौधे हैं जिनमें एक प्रजाति का नाभिक होता है लेकिन दोनों माता-पिता की प्रजातियों से साइटोप्लाज्म (cytoplasm) होता है। सामान्य प्रोटोप्लास्ट संलयन प्रयोगों में निम्नलिखित में से किसी एक कारण से चर आवृत्तियों (variable frequencies) में इनका उत्पादन होता है:
निम्नलिखित द्वारा साइब्रिड अपेक्षाकृत उच्च आवृत्ति (high frequency) में उत्पन्न किए जा सकते हैं:
साइब्रिड उत्पादन (cybrid production) का उद्देश्य एक प्रजाति के साइटोप्लाज्मिक जीन (cytoplasmic genes) को दूसरी प्रजाति के परमाणु और साइटोप्लाज्मिक जीन (nuclear and cytoplasmic genes) के साथ जोड़ना है। लेकिन प्लाज्मा जीन (plasma genes) का समसूत्री अलगाव (mitotic segregation), जैसा कि क्लोरोप्लास्ट के वितरण से स्पष्ट होता है, उन पौधों की वसूली (recovery) की ओर ले जाता है जिनमें केवल एक या अन्य प्रजाति के प्लाज्मा जीन होते हैं। पौधों का केवल एक छोटा सा हिस्सा ही साइब्रिड बना रहता है।
यह निम्नलिखित अनुप्रयोग प्रदान करता है:
साइब्रिड दृष्टिकोण का उपयोग साइटोप्लाज्मिक पुरुष बाँझपन (cytoplasmic male sterility - CMS) को Nicotiana tabacum से N. sylvestris और P. hybrida से P. axillaries में स्थानांतरित करने के लिए किया गया है।
साइब्रिडाइजेशन के माध्यम से CMS लाइनों के उत्पादन के लाभ (Advantages of production of CMS lines through cybridization)
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