प्रोटोप्लास्ट संलयन (protoplast fusion) के माध्यम से सफलतापूर्वक प्राप्त किए गए कायिक संकरों (somatic hybrids) के गुणसूत्रों की संख्या से संकेत मिलता है कि केवल कुछ में एम्फीप्लॉइड (amphiploid) में अपेक्षित सटीक संख्या होती है। इसलिए, यदि वास्तविक एम्फीप्लॉइड (true amphiploids) प्राप्त करने की आवश्यकता है, तो कोशिका विज्ञान स्तर (cytological level) पर भी चयन लागू करने की आवश्यकता होगी। संकरों में गुणसूत्र संख्या (chromosome number) में परिवर्तनशीलता निम्नलिखित कारणों में से किसी के कारण हो सकती है:
दैहिक कोशिका संलयन (Somatic cell fusion) एकमात्र ऐसा दृष्टिकोण प्रतीत होता है जिसके माध्यम से दो अलग-अलग पैतृक जीनोम (parental genomes) को उन पौधों के बीच पुनर्संयोजित किया जा सकता है जो यौन रूप से प्रजनन (reproduce sexually) नहीं कर सकते हैं। इसके अलावा, यौन रूप से बाँझ (sexually sterile) (अगुणित - haploid, त्रिगुणित - triploid और असुगुणित - aneuploid) पौधों के प्रोटोप्लास्ट को संलयित करके उपजाऊ द्विगुणित (fertile diploids) और बहुगुणित (polyploids) का उत्पादन किया जा सकता है। तंबाकू (tobacco) के अगुणित प्रोटोप्लास्ट के संलयन से उत्पादित एम्फिडिप्लॉइड (amphidiploid) और हेक्साप्लॉइड (hexaploid) पौधों का वर्णन करने वाली कई रिपोर्टें हैं। डाइहाप्लॉइड आलू क्लोन (dihaploid potato clones) से पृथक प्रोटोप्लास्ट को Solanum brevidens के पृथक प्रोटोप्लास्ट के साथ संलयित किया गया है ताकि व्यावहारिक प्रजनन मूल्य (practical breeding value) के संकर उत्पन्न किए जा सकें। चावल की किस्मों के एक परागकोष-व्युत्पन्न कैलस (anther-derived callus) से अगुणित प्रोटोप्लास्ट, संलयन पर भी उपजाऊ द्विगुणित और त्रिगुणित संकर (fertile diploid and triploid hybrids) उत्पन्न करते हैं।
पादप प्रजनन कार्यक्रमों (plant breeding programmes) में, अंतर-विशिष्ट (interspecific) या अंतर-जातीय (intergeneric) स्तरों पर यौन संकरण अक्सर असंगति बाधाओं (incompatibility barriers) के कारण संकर (hybrids) का उत्पादन करने में विफल होते हैं। इसलिए यौन संकरण में आने वाली बाधाओं को दैहिक कोशिका संलयन द्वारा दूर किया जा सकता है। कुछ मामलों में दो असंगत पौधों के बीच कायिक संकरों का उपयोग उद्योग या कृषि में भी पाया गया है।
शीडर (Schieder, 1978) ने उनके द्विगुणित मेसोफिल प्रोटोप्लास्ट (diploid mesophyll protoplasts) को संलयित करके एम्फिडिप्लॉइड Datura innoxia (+) D. discolor और D. innoxia (+) D. stramonium प्राप्त किया। ये संकर प्रकृति में मौजूद नहीं थे क्योंकि पारंपरिक प्रजनन प्रक्रियाएं असफल साबित हुईं। Datura प्रजातियों के इन संयोजनों के दैहिक रूप से उत्पादित एम्फिडिप्लॉइड (amphidiploids) औद्योगिक उपयोग के लिए प्रचारित किए जाते हैं क्योंकि वे पैतृक रूपों की तुलना में हेटेरोसिस (heterosis) और उच्च (20-25%) स्कोपोलामाइन (scopolamine) सामग्री प्रदर्शित करते हैं।
Nicotiana repanda, N. nesophila और N. stockonii कई बीमारियों के प्रतिरोधी हैं लेकिन तंबाकू (N. tabacum) के साथ यौन रूप से संकरण (sexually crossable) योग्य नहीं हैं। हालांकि, प्रोटोप्लास्ट संलयन द्वारा संयोजन N. tabacum (+) N. nesophila और N. tabacum (+) N. stocktonii में उपजाऊ संकरों की सूचना दी गई है। Solanum brevidens, S. phureja और S. pennelii के पृथक प्रोटोप्लास्ट के साथ डाइहाप्लॉइड और टेट्राप्लॉइड आलू प्रोटोप्लास्ट के कायिक संकरण (Somatic hybridisation) के परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण कृषि लक्षणों (agricultural traits) वाले उपजाऊ, आंशिक रूप से एम्फियुप्लॉइड पौधों (amphieuploid plants) का संश्लेषण हुआ, उदाहरण के लिए, आलू पत्ती वायरस (potato leaf virus), आलू वायरस Y (potato virus Y) और इरविनिया सॉफ्ट रॉट (Erwinia soft rot) का प्रतिरोध। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, कई जंगली प्रजातियों (wild species) के साथ दैहिक रूप से संकरित टमाटर (Lycopersicon esculentum) के परिणामस्वरूप संकरों का संश्लेषण हुआ है जो उपजाऊ हैं और प्रजनन कार्यक्रमों (breeding programmes) में उपयोग किए जाते हैं। बैंगन (Solanum melongena) के साथ यौन रूप से असंगत प्रजातियों से जुड़े अंतर-विशिष्ट कायिक संकरण (Interspecific somatic hybridisation) के परिणामस्वरूप वर्टिसिलियम विल्ट (verticillium wilt) के प्रतिरोधी लक्षणों के साथ एम्फिडिप्लॉइड का उत्पादन भी हुआ है।
रेपसीड (Brassica napus) B. oleracea और B. campestris का एक प्राकृतिक एम्फिडिप्लॉइड (natural amphidiploid) है। शेंक (Schenk, 1982) प्रोटोप्लास्ट संलयन का उपयोग करके इन विट्रो (in vitro) में रेपसीड का पुनः संश्लेषण करने वाले पहले व्यक्ति थे। फोमा लिंगम (Phoma lingam) के प्रतिरोध के लिए जीन रखने वाली B. napus और B. nigra किस्म के बीच कायिक संकरण ने इस जीन को ले जाने वाले एम्फिडिप्लॉइड पौधों को उत्पन्न किया। इन संकरों में सभी तीन Brassica जीनोम (A, B और C) होते हैं और अब इन्हें प्रजनन कार्यक्रमों में शामिल किया गया है। हाल ही में, Brassica juncea (उष्णकटिबंधीय दुनिया की एक प्रमुख तिलहन फसल) और यौन रूप से असंगत प्रजातियों Diplotaxis muralis और Erica sativa के बीच प्रोटोप्लास्ट संलयन द्वारा पैरासेक्सुअली (parasexually) संकर उत्पन्न किए गए हैं।
बारहमासी वृक्ष प्रजनन (perennial tree breeding) में कायिक संकरण की क्षमता का सबसे अच्छा उदाहरण साइट्रस (citrus) प्रजातियों के बीच अंतर-विशिष्ट और अंतर-जातीय कायिक संकरण (interspecific and intergeneric somatic hybridisation) है। इन प्रयोगों के माध्यम से उत्पादित कायिक संकर एम्फिडिप्लॉइड हैं जिनमें सायन सुधार (scion improvement) और बढ़ी हुई रूटस्टॉक क्षमता (increased rootstock potential) की विशेषताएं हैं।
एक प्रजाति के केंद्रक (nucleus) को दूसरी प्रजाति के कोशिकाद्रव्य (cytoplasm) में प्रतिस्थापित करने के तरीके भी विकसित किए गए थे, जिनके माइटोकॉन्ड्रिया (mitochondria) निष्क्रिय हो गए थे। कुछ मामलों में इस प्रकार के प्रतिस्थापन के कारण साइटोप्लाज्मिक नर बंध्यता (cytoplasmic male sterility) उत्पन्न हुई।
इस उद्देश्य के लिए, कायिक संकरों के उत्पादन के लिए उपयोग किए जाने वाले दो प्रकार के प्रोटोप्लास्ट को निम्न प्रकार से अलग-अलग तरीके से उपचारित किया गया:
प्रोटोप्लास्ट को 1:1 के अनुपात में मिलाया गया और Ca2+ और PEG का उपयोग करके संलयन करने के लिए प्रेरित किया गया, जिससे हेटेरोलॉगस (heterologous) या एलोप्लास्मिक संकरों (alloplasmic hybrids) का उत्पादन हुआ। संलयन उत्पादों में, कुछ संकर टमाटर के पौधे आकारिकी (morphology), शरीर क्रिया विज्ञान (physiology) और गुणसूत्र संख्या (2n = 24) के संबंध में मूल किस्मों से अप्रभेद्य (indistinguishable) थे, लेकिन नर बंध्यता के विभिन्न डिग्री प्रदर्शित करते थे। टमाटर की पांच किस्मों में, इस तरह से प्रेरित नर बंध्यता (male sterility) कई पीढ़ियों तक मातृ रूप से (maternally) वंशागत हुई। इसलिए, यह स्पष्ट रूप से साइटोप्लाज्मिक नर बंध्यता थी। इन CMS संकरों का माइटोकॉन्ड्रियल DNA (mtDNA) किसी भी मूल पौधे के mtDNA से मिलता-जुलता नहीं था, और इसके बजाय पुनर्संयोजक प्रकार (recombinant type) का था, जो एक संकर माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम का प्रतिनिधित्व करता था। इसलिए, प्रोटोप्लास्ट संलयन का उपयोग CMS लाइनों के उत्पादन के लिए प्रभावी ढंग से किया जा सकता है और इसके निम्नलिखित फायदे हैं:
संलयन द्वारा साइटोप्लाज्मिक नर बंध्यता का जनन (Generation of cytoplasmic male sterility by fusion)
1. IOA (माइटोकॉन्ड्रिया को नुकसान पहुंचाता है), 2. γ किरणें या x-किरणें (केंद्रक को निष्क्रिय करती हैं), 3. माइटोकॉन्ड्रिया, 4. क्लोरोप्लास्ट (chloroplast) (टमाटर प्रोटोप्लास्ट), 5. Ca++ + PEG, 6. प्रोटोप्लास्ट संलयन, 7. क्लोरोप्लास्ट (आलू या S.acaule प्रोटोप्लास्ट), 8. केंद्रक, 9. टमाटर केंद्रक, 10. पुनर्संयोजक माइटोकॉन्ड्रिया (recombinant mitochondria), 11. क्लोरोप्लास्ट (मिश्रण), 12. संलयित प्रोटोप्लास्ट (fused protoplasts), 13. कायिक संकर पौधे (somatic hybrid plants) (CMS) - टमाटर के समान
पॉवर और अन्य (Power et al., 1975) ने Petunia के मेसोफिल प्रोटोप्लास्ट को Parthenocissus के क्राउन गॉल (crown gall) के संवर्धित कोशिका प्रोटोप्लास्ट (cultured cell protoplasts) के साथ संलयित किया और एक ऐसी लाइन का चयन किया जिसमें केवल Parthenocissus के गुणसूत्र शामिल थे, लेकिन कुछ समय के लिए Petunia के कुछ साइटोप्लाज्मिक गुणों को प्रदर्शित किया। इसके बाद Nicotiana techne से N. tabacum, N. tabacum से N. sylvestris और Petunia hybrida से P. axillaris में साइटोप्लाज्मिक नर बंध्यता के स्थानांतरण द्वारा कृषि जैव प्रौद्योगिकी में साइब्रिडाइजेशन (cybridisation) का प्रत्यक्ष अनुप्रयोग (direct application) किया गया। साइटोप्लाज्मिक नर बंध्यता के अलावा, साइटोप्लाज्म का जीनोफोर (genophore) कई व्यावहारिक रूप से महत्वपूर्ण लक्षणों (traits) के लिए कोड करता है, जैसे प्रकाश संश्लेषण (photosynthesis) की दर, निम्न या उच्च तापमान सहिष्णुता (temperature tolerance) और बीमारियों या शाकनाशियों (herbicides) का प्रतिरोध। साइब्रिडाइजेशन पर हाल के प्रयोगों के परिणामस्वरूप दोनों माता-पिता से माइटोकॉन्ड्रियल DNA (mt DNA) और cp DNA एन्कोडेड (encoded) लक्षणों को मिलाकर पुनर्निर्मित साइटोप्लाज्म (reconstructed cytoplasm) वाले पौधे प्राप्त हुए हैं।
व्यावहारिक उद्देश्यों के लिए साइटोप्लाज्म के पुनर्निर्माण में प्रोटोप्लास्ट संलयन की क्षमता को दर्शाने वाला सबसे अच्छा उदाहरण Brassica जीनस (genus) है। साइटोप्लाज्मिक जीन द्वारा कोडित दो वांछनीय लक्षणों को Brassica की विभिन्न प्रजातियों के बीच अंतर-विशिष्ट साइब्रिडाइजेशन (interspecific cybridisation) के माध्यम से आनुवंशिक रूप से संशोधन किया गया है। इन लक्षणों में साइटोप्लाज्मिक नर बंध्यता और एट्राज़िन शाकनाशियों (atrazine herbicides) का प्रतिरोध शामिल है। Brassica पौधों, Diplotaxis muralis और Raphanus sativus में cms जीन एलोप्लास्मिक (alloplasmic) (एक विदेशी कोशिकाद्रव्य में एक प्रजाति का केंद्रक) मूल का है। Raphanus sativus रुचि का विषय है क्योंकि यह पूर्ण नर बंध्यता की ओर ले जाता है। इस पौधे से रेपसीड (Brassica napus) में Cms रिस्टोरर जीन (Cms restorer genes) पेश किए गए हैं। एट्राज़िन शाकनाशी (atrazine herbicide) के प्रतिरोधी उत्परिवर्ती (Mutants) Brassica napus और B. campesteris दोनों में खोजे गए हैं। प्रोटोप्लास्ट संलयन प्रयोगों (विभिन्न प्रयोगशालाओं में आयोजित) के परिणामस्वरूप दोनों cms (Raphanus mt DNA द्वारा कोडित) और निम्न तापमान सहिष्णुता (low temperature tolerance) या एट्राज़िन प्रतिरोध (Brassica cp DNA द्वारा कोडित) के संयोजन के साथ पुनर्निर्मित साइटोप्लाज्म के साथ साइब्रिड (cybrid) पौधों का संश्लेषण हुआ है। इसी तरह, एट्राज़िन प्रतिरोध और cms के लिए कोडिंग करने वाले साइटोप्लाज्मिक जीन को गोभी (cabbage), चावल और आलू में स्थानांतरित कर दिया गया है。
कायिक संकरण और साइब्रिडाइजेशन में, आवश्यक पूर्व शर्त यह है कि पैतृक प्रोटोप्लास्ट और उनके संलयन उत्पाद पूरे पौधों में पुनर्जीवित (regenerate) होते हैं। पिछले एक दशक में अनुसंधान ने दिखाया है कि आवृत्तबीजी (angiosperm) परिवारों की एक श्रृंखला से संबंधित प्रजातियों के पृथक प्रोटोप्लास्ट से इन विट्रो में पौधे उगाए जा सकते हैं। यौन रूप से संगत (sexually compatible) और साथ ही असंगत प्रजातियों के बीच कायिक संकर उत्पन्न किए गए हैं। प्रोटोप्लास्ट संलयन द्वारा प्रीजाइगोटिक भ्रूण/भ्रूणपोष (prezygotic embryo/endosperm) (Petunia parodii (+) P. inflate) और पोस्टजाइगोटिक (postzygotic) (Datura innoxia (+) D. stramonium; Petunia parodii (+) P. parviflora), असंगति बाधाओं को दूर करना संभव हो सकता है। अंतर-जातीय कायिक संकरण (intergeneric somatic hybridisation) पर प्रयोग कुछ मामलों में सफल रहे हैं जैसे आलू (+) टमाटर कायिक संकर और 'अरबीडोब्रासिका' ('Arabidobrassica') का संश्लेषण। इन प्रारंभिक सफलताओं और प्रोटोप्लास्ट प्रौद्योगिकी में बाद की प्रगति के साथ, यह वांछनीय है कि महत्वपूर्ण पौधों की प्रजातियों पर ध्यान केंद्रित किया जाए जिनकी उद्योग या खाद्य उत्पादन में क्षमता है। ऐसी फसलें जो आनुवंशिक संशोधन (genetic manipulation) के पारंपरिक तरीकों से संतोषजनक परिणाम नहीं दे पाई हैं, उन्हें अपनी पूरी क्षमता प्रदर्शित करने के लिए कायिक संकरण/साइब्रिडाइजेशन (somatic hybridisation/cybridisation), भ्रूण संवर्धन (embryo culture) आदि जैसी गैर-पारंपरिक इन विट्रो तकनीकों द्वारा सहायता प्रदान करने की आवश्यकता है।
| मूल प्रजाति और उनके गुणसूत्र संख्या (Parent species and their chromosome numbers) | संकर की गुणसूत्र संख्या (Chromosome number of hybrid) |
|---|---|
| Brassica oleracea (2n = 18) + B. campestris (2n = 20) | B. napus (2n = 38) + B. oleracea (2n = 18) |
| B. napus (2n = 38) + B. nigra (2n = 16) | B. napus (2n = 38) + B. carinata (2n = 34) |
| B. napus (2n = 38) + B. juncea (2n = 36) | व्यापक भिन्नता (Wide variation) |
| Nicotiana glauca (2n = 24) + N. longsdorfii (2n = 18) | 56-64 |
| N. tabacum (2n = 48) + N. alata (2n = 18) | 66-71 |
| N. tabacum (2n = 48) + N. glauca (2n = 24) | 72 |
| N. tabacum (2n = 48) + N. glutinosa (2n = 24) | 50-88 |
| N. tabacum (2n = 48) + N. knightiana (2n = 24) | 44-137 |
| N. tabacum (2n = 48) + N. mesophila (2n = 48) | 96 |
| N. tabacum (2n = 48) + N. octophora (2n = 24) | 48 |
| N. tabacum (2n = 48) + N. rustica (2n = 48) | 60-91 |
| N. tabacum (2n = 48) + N. stocktonii (2n = 48) | 96 |
| N. tabacum (2n = 48) + N. sylvestris (2n = 24) | 72 |
| N. tabacum (2n = 48) + N. plumbaginifolia (2n = 20) | - |
| Petunia parodii (2n = 14) + P. hybrida (2n = 14) | 44-48 / 46 |
| P. parodii (2n = 14) + P. parviflora (2n = 18) | 31-40 |
| Solanum tuberosum (2n = 24, 48) + S. chacoense (2n = 14) | 60 |
| S. tuberosum (2n = 24, 48) + S. brevidens (2n = 24) | - |
| Lycopersicon esculentum (2n = 24) + L. peruvianum (2n = 14) | 72 |
| Daucus carota (2n = 18) + D. capillifolius (2n = 18) | 36, 38 |
| Datura innoxia (2n = 24) + D. capillifolius (2n = 24) | 46, 48, 72 |
| D. innoxia (2n = 24) + D. sanguinea (2n = 24) | 46, 72, 96 |
| D. innoxia (2n = 24) + D. candida (2n = 24) | - |
| पौधों की प्रजातियां और उनके गुणसूत्र संख्या (Plant species and their chromosome numbers) | नया जीनस (New genus) |
|---|---|
| Raphanus sativus (2n = 18) + B. oleracea (2n = 18) | Raphanobrassica |
| Moricandia arvensis (2n = 24, 28) + B. oleracea (2n = 18) | Moricandiobrassica |
| Eruca sativa (2n = 22) + B. napus (2n = 38) | Erucobrassica |
| E. sativa (2n = 22) + B. juncea (2n = 36) | Erussica |
| Diplotaxis muralis (2n = 42) + B. napus (2n = 38) | Diplotaxobrassica |
| D. muralis (2n = 42) + B. juncea (2n = 36) | Diplotaxojuncea |
| Sinapis alba (2n = 24) + B. napus (2n = 38) | Sinapobrassica |
| S. alba (2n = 24) + B. oleracea (2n = 18) | Sinapo-oleracea |
| Nicotiana tabacum (2n = 24) + Lycopersicon esculentum (2n = 24) | Nicotiopersicon |
| N. tabacum (2n = 24) + Petunia inflorata (2n = 14) | Nicotiopetunia |
| Solanum tuberosum (2n = 24) + Lycopersicon esculentum (2n = 24) | Solanopersicon |
| Daucus carota (2n = 18) + Petroselinum hortense (2n = 22) | Daucoselenium |
| Datura innoxia (2n = 48) + Atropa belladonna (2n = 24) | Daturotropa |
| Oryza sativa (2n = 24) + Echinochloa oryzicola (2n = 24) | Oryzochloa |
| मूल प्रजातियां 1 (Parent Species 1) | मूल प्रजातियां 2 (Parent Species 2) | संकर (Hybrid) |
|---|---|---|
| Arabidopsis thaliana (जनजाति सिसिम्ब्रिए - Tribe Sisymbrieae) (2n = 10) | B. campestris (2n = 20) (जनजाति ब्रैसिसे - Tribe Brassiceae) | Arabidobrassica |
| Thlaspi perfoliatum (जनजाति लेपिडिए - Tribe Lepideae) (2n = 14) | B. napus (2n = 38) (जनजाति ब्रैसिसे - Tribe Brassiceae) | Thlaspobrassica |
| Barbarea vulgaris (जनजाति अरेबिडिए - Tribe Arabideae) (2n = 16) | B. napus (2n = 38) (जनजाति ब्रैसिसे - Tribe Brassiceae) | Barbareobrassica |
यौन रूप से संगत पौधों (sexually compatible plants) के कायिक संकर भी प्रोटोप्लास्ट संलयन के दौरान पैतृक प्रजातियों द्वारा दान किए गए प्लास्टोम्स (plastomes) के बीच अंतःक्रिया के परिणामस्वरूप नई विविधताएं प्रदर्शित कर सकते हैं। नई प्रजातियों में प्रतिरोध के लिए जीन की शुरूआत के लिए नर बंध्यता के स्थानांतरण के अलावा साइब्रिडाइजेशन की तकनीक अपनाई जा सकती है। नाइट्रोजन स्थिरीकरण (nitrogen fixation) के संबंध में पौधों के संशोधन (modification) पर भी इस लक्षण (trait) को ले जाने वाले एक्सोजेनस DNA (exogenous DNA), या ऑर्गेनेल (organelles) के तेज से प्रोटोप्लास्ट के परिवर्तन (transformation) के माध्यम से विचार किया जा सकता है। इसके अलावा, आनुवंशिक रूप से विषम क्लोन (genetically heterogenous clones) प्रोटोप्लास्ट संवर्धन और संलयन से प्राप्त किए जा सकते हैं जो कई कृषि संबंधी लक्षणों (agronomic traits) के लिए भिन्नताओं की उच्च आवृत्ति प्रदर्शित करते हैं।
उपरोक्त विकास फसल सुधार में दैहिक कोशिका आनुवंशिकी (somatic cell genetics) के लिए अपार क्षमता का सुझाव देते हैं। हालांकि, दैहिक कोशिका संलयन के माध्यम से उत्पन्न होने वाली आनुवंशिक विविधता अभी भी खराब समझी जाती है। ऐसा इसलिए है क्योंकि संश्लेषित (synthesised) कायिक संकर या साइब्रिड्स में से केवल एक बहुत ही सीमित संख्या उपजाऊ या एम्फिप््लॉइड (amphiploids) रही है। वांछनीय असममित परमाणु संकर (asymmetric nuclear hybrids) के उत्पादन के तंत्र को समझने के लिए व्यापक या दूर के कायिक संकरण (distant somatic hybridisation) में प्रजातियों-विशिष्ट गुणसूत्र उन्मूलन (species-specific chromosome elimination) की डिग्री पर प्रेरण और नियंत्रण में महारत हासिल करने की आवश्यकता है।
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