ट्रांसजेनिक जानवरों (transgenic animals) के उत्पादन के लिए, DNA को आमतौर पर निषेचन (fertilization) के बाद बहुत प्रारंभिक अवस्था में भ्रूण कोशिकाओं (embryonic cells) के प्रोन्यूक्लिआई (pronuclei) में माइक्रोइन्जेक्ट (microinjected) किया जाता है, या वैकल्पिक रूप से भ्रूण स्टेम (embryo stem - ES) कोशिकाओं के जीन लक्ष्यीकरण (gene targeting) का उपयोग किया जाता है। जानवरों में यह विशेष इन विट्रो निषेचन (in vitro fertilization) तकनीक की उपलब्धता के कारण संभव है, जो डिंब (ovule), युग्मनज (zygote) या प्रारंभिक भ्रूण (early embryo) के संशोधन (manipulation) की अनुमति देता है।
पौधों में ऐसी तकनीकें उपलब्ध नहीं हैं। उच्च पौधों (higher plants) में इसके विपरीत, कोशिकाओं या प्रोटोप्लास्ट (protoplasts) को संवर्धित (cultured) किया जा सकता है और पूरे पौधों के पुनर्जनन (regeneration) के लिए उपयोग किया जा सकता है। इसलिए, इन प्रोटोप्लास्ट का उपयोग जीन स्थानांतरण (gene transfer) के लिए किया जा सकता है, जिसके बाद पुनर्जनन होता है जिससे ट्रांसजेनिक पौधों (transgenic plants) का उत्पादन होता है। संवर्धित कोशिकाओं (cultured cells) और प्रोटोप्लास्ट के अलावा, अन्य मेरिस्टेम कोशिकाओं (meristem cells - अपरिपक्व भ्रूण या अंग), पराग (pollen) या युग्मनज (zygotes) का भी पौधों में जीन स्थानांतरण के लिए उपयोग किया जा सकता है। पौधों की प्रजातियों की विशाल विविधता और एक प्रजाति में विविध जीनोटाइप (genotypes) की उपलब्धता ने विभिन्न स्थितियों के अनुकूल विभिन्न तकनीकों को विकसित करना आवश्यक बना दिया है। पौधों में जीन स्थानांतरण की इन विभिन्न विधियों पर चर्चा की गई है।
जीन स्थानांतरण तकनीक (gene transfer technology) में पहला कदम उन कोशिकाओं का चयन करना है जो संपूर्ण रूपांतरित पौधों (transformed plants) को जन्म देने में सक्षम हैं। पुनर्जनन के बिना रूपांतरण (transformation) और रूपांतरण के बिना पुनर्जनन का सीमित महत्व है। कई प्रजातियों में, इन प्रकार की कोशिकाओं की पहचान करना मुश्किल है। यह जानवरों की स्थिति के विपरीत है, क्योंकि पौधों की कोशिकाएं टोटीपोटेंट (totipotent) होती हैं और उन्हें ऑर्गनोजेनेसिस (organogenesis) या भ्रूणजनन (embryogenesis) के माध्यम से इन विट्रो (in vitro) में पूरे पौधों में पुनर्जीवित (regenerate) होने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। हालांकि, इन विट्रो प्लांट पुनर्जनन में 'जीनोम स्ट्रेस (genome stress)' का एक स्तर होता है, खासकर अगर पौधों को कैलस चरण (callus phase) के माध्यम से पुनर्जीवित किया जाता है। इससे पुनर्जीवित पौधों में गुणसूत्रीय (chromosomal) या आनुवंशिक (genetic) असामान्यताएं हो सकती हैं, जिसे सोमाक्लोनल विविधता (somaclonal variation) कहा जाता है।
इसके विपरीत, पराग (या संभवतः अंड कोशिकाओं - egg cells) में जीन स्थानांतरण आनुवंशिक रूप से रूपांतरित युग्मकों (genetically transformed gametes) को जन्म दे सकता है, जिनका उपयोग निषेचन (fertilization - in vivo) के लिए किए जाने पर रूपांतरित पूर्ण पौधों को जन्म दे सकता है। इसी तरह, युग्मनज (zygote - in vivo या in vitro) में DNA के सम्मिलन (insertion) के बाद भ्रूण बचाव (embryo rescue) का उपयोग ट्रांसजेनिक पौधों का उत्पादन करने के लिए भी किया जा सकता है। एक और वैकल्पिक दृष्टिकोण भ्रूण (embryos) या मेरिस्टेम (meristems) में अलग-अलग कोशिकाओं का उपयोग है, जिन्हें इन विट्रो में उगाया जा सकता है या ट्रांसजेनिक पौधों के उत्पादन के लिए सामान्य रूप से विकसित होने दिया जा सकता है।
अधिकांश वैक्टर (vectors) मार्कर जीन (marker genes) ले जाते हैं, जो रूपांतरित कोशिकाओं (transformed cells) की पहचान की अनुमति देते हैं (अन्य कोशिकाएं एंटीबायोटिक या शाकनाशी की क्रिया के कारण मर जाती हैं) और उन्हें चयन योग्य मार्कर (selectable markers) के रूप में वर्णित किया जाता है। इन मार्कर जीनों में, सबसे आम चयन योग्य मार्कर npt II है, जो कैनामाइसिन प्रतिरोध (kanamycin resistance) प्रदान करता है। उपयुक्त रूपांतरण वेक्टर की अन्य सामान्य विशेषताओं में निम्नलिखित शामिल हैं: (i) एकाधिक अद्वितीय प्रतिबंध स्थल (multiple unique restriction sites - एक सिंथेटिक पॉलीलिंकर); (ii) प्रतिकृति के जीवाणु मूल (bacterial origins of replication - उदाहरण के लिए ColE1)।
इन गुणों वाले वैक्टरों में जरूरी नहीं कि ऐसी विशेषताएं हों, जो पौधे की कोशिकाओं में उनके स्थानांतरण या पौधे के परमाणु जीनोम (plant nuclear genome) में एकीकरण (integration) की सुविधा प्रदान करें। इसलिए, एग्रोबैक्टीरियम (Agrobacterium) Ti प्लास्मिड को अन्य सभी वैक्टरों पर प्राथमिकता दी जाती है, क्योंकि इस जीवाणु प्रणाली (bacterial system) की व्यापक परपोषी सीमा (wide host range) है और T-DNA सीमा अनुक्रमों (T-DNA border sequences) की उपस्थिति के कारण जीन स्थानांतरित करने की क्षमता है।
पौधों में आनुवंशिक रूपांतरण (genetic transformation) प्राप्त करने के लिए, हमें एक वेक्टर (जेनेटिक वाहन) के निर्माण की आवश्यकता होती है जो आवश्यक नियंत्रक अनुक्रमों (controlling sequences) यानी प्रमोटर (promoter) और टर्मिनेटर (terminator) से घिरे रुचि के जीन को स्थानांतरित करता है, और जीन को परपोषी पौधे (host plant) में पहुंचाता है। पौधों में जीन स्थानांतरण के दो प्रकार के तरीके हैं:
पौधों के रूपांतरण में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न वैक्टरों में, Agrobacterium tumefaciens का Ti प्लास्मिड व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। इस जीवाणु को पौधों के "प्राकृतिक आनुवंशिक इंजीनियर (natural genetic engineer)" कहते हैं क्योंकि इन जीवाणुओं में कोशिकाओं के घाव स्थल (wound site) पर संक्रमण (infection) होने पर अपने प्लास्मिड के T-DNA को पौधे के जीनोम में स्थानांतरित करने की प्राकृतिक क्षमता होती है और इससे कोशिका द्रव्यमान की असंगठित वृद्धि (unorganized growth) होती है जिसे क्राउन गॉल (crown gall) कहा जाता है। Ti प्लास्मिड का उपयोग उपयोगी बहिर्जात जीनों (foreign genes) को लक्षित पौधे की कोशिकाओं और ऊतकों में पहुंचाने के लिए जीन वैक्टर (gene vectors) के रूप में किया जाता है। अवांछित अनुक्रमों के स्थान पर बहिर्जात जीन को Ti-प्लास्मिड के T-DNA क्षेत्र में क्लोन (cloned) किया जाता है। पौधों को बदलने के लिए, पत्ती डिस्क (leaf discs - डिकोट्स के मामले में) या भ्रूण कैलस (embryogenic callus - मोनोकॉट के मामले में) एकत्र किए जाते हैं और पुनः संयोजक निरस्त्र (recombinant disarmed) Ti-प्लास्मिड वेक्टर ले जाने वाले Agrobacterium से संक्रमित होते हैं। संक्रमित ऊतक (infected tissue) को फिर 2-3 दिनों के लिए प्ररोह पुनर्जनन माध्यम (shoot regeneration medium) पर सह-संवर्धित (co-cultivation) किया जाता है, जिस दौरान बहिर्जात जीन के साथ T-DNA का स्थानांतरण होता है। इसके बाद, रूपांतरित ऊतकों (पत्ती डिस्क/कैली) को चयन सह पौधे पुनर्जनन माध्यम (selection cum plant regeneration medium) में स्थानांतरित किया जाता है, जो आमतौर पर एक एंटीबायोटिक की घातक एकाग्रता (lethal concentration) के साथ पूरक (supplemented) होता है ताकि गैर-रूपांतरित ऊतकों को चुनिंदा रूप से समाप्त (selectively eliminate) किया जा सके। 3-5 सप्ताह के बाद, पुनर्जीवित प्ररोह (regenerated shoots - पत्ती डिस्क से) को जड़-उत्प्रेरण माध्यम (root-inducing medium) में स्थानांतरित कर दिया जाता है, और एक और 3-4 सप्ताह के बाद, पुनर्जीवित पौधों के सख्त (hardening/acclimatization) होने के बाद पूरे पौधों को मिट्टी में स्थानांतरित कर दिया जाता है। ट्रांसजेनिक पौधों में बहिर्जात जीन की उपस्थिति का पता लगाने के लिए PCR और दक्षिणी संकरण (southern hybridization) जैसी आणविक तकनीकों का उपयोग किया जाता है।
उच्च पौधों में जीन स्थानांतरण के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले वैक्टर मिट्टी के जीवाणु (soil bacterium) Agrobacterium tumefaciens के ट्यूमर प्रेरित तंत्र (tumour inducing mechanism) पर आधारित हैं, जो क्राउन गॉल रोग का कारण जीव है। एक निकट संबंधित प्रजाति A. rhizogenes बालों वाली जड़ (hairy root) रोग का कारण बनती है। इन बीमारियों के आणविक आधार (molecular basis) की समझ ने जीन स्थानांतरण प्रणाली विकसित करने के लिए इन जीवाणुओं के उपयोग को प्रेरित किया। यह दिखाया गया है कि रोग जीवाणु से पौधे के परमाणु जीनोम में DNA खंड (DNA segment) के स्थानांतरण के कारण होता है। DNA खंड जो स्थानांतरित होता है उसे T-DNA कहा जाता है और यह Agrobacterium tumefaciens के विषैले उपभेदों (virulent strains) में पाए जाने वाले एक बड़े Ti (ट्यूमर प्रेरक - tumour inducing) प्लास्मिड का हिस्सा है। इसी तरह Ri (रूट इंड्यूसिंग - root inducing) मेगाप्लास्मिड (megaplasmids) A. rhizogenes के विषैले उपभेदों में पाए जाते हैं।
अधिकांश Ti प्लास्मिड में चार क्षेत्र (regions) समान होते हैं, (i) क्षेत्र A (Region A), जिसमें T-DNA शामिल है, ट्यूमर प्रेरण (tumour induction) के लिए जिम्मेदार है, ताकि इस क्षेत्र में उत्परिवर्तन (mutations) से परिवर्तित आकारिकी (altered morphology - प्ररोह या जड़ उत्परिवर्ती पित्त - shooty or rooty mutant galls) वाले ट्यूमर का उत्पादन होता है। इस क्षेत्र के समरूप अनुक्रम (homologous sequences) हमेशा पौधे के परमाणु जीनोम में स्थानांतरित किए जाते हैं, ताकि क्षेत्र को T-DNA (स्थानांतरित DNA - transferred DNA) के रूप में वर्णित किया जा सके। (ii) क्षेत्र B (Region B) प्रतिकृति (replication) के लिए जिम्मेदार है। (iii) क्षेत्र C (Region C) संयुग्मन (conjugation) के लिए जिम्मेदार है। (iv) क्षेत्र D (Region D) उग्रता (virulence) के लिए जिम्मेदार है, ताकि इस क्षेत्र में उत्परिवर्तन उग्रता को समाप्त कर दे। इसलिए इस क्षेत्र को उग्रता (virulence - vir) क्षेत्र कहा जाता है और पौधे के परमाणु जीनोम में T-DNA के स्थानांतरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इस Ti प्लास्मिड के घटकों का उपयोग कुशल पौधे परिवर्तन वैक्टर (efficient plant transformation vectors) विकसित करने के लिए किया गया है।
T-DNA में निम्नलिखित क्षेत्र शामिल हैं: (i) एक क्षेत्र जिसमें तीन जीन (दो जीन tms और tms2 'शूटी लोकस - shooty locus' का प्रतिनिधित्व करते हैं और एक जीन tmr 'रूपी लोकस - rooty locus' का प्रतिनिधित्व करता है) शामिल हैं, जो दो फाइटोहोर्मोन (phytohormones), अर्थात् इंडोल एसिटिक एसिड (indole acetic acid - एक ऑक्सिन - auxin) और आइसोपेंटाइलएडेनोसिन 5'-मोनोफॉस्फेट (isopentyladenosine 5'-monophosphate - एक साइटोकिनिन - cytokinin) के जैवसंश्लेषण (biosynthesis) के लिए जिम्मेदार हैं। ये जीन इन फाइटोहोर्मोन के संश्लेषण (synthesis) के लिए जिम्मेदार एंजाइमों (enzymes) को एनकोड (encode) करते हैं, ताकि पौधे के परमाणु जीनोम में इन जीनों को शामिल करने से परपोषी पौधे में इन फाइटोहोर्मोन का संश्लेषण होता है। फाइटोहोर्मोन बदले में विकासात्मक कार्यक्रम (developmental programme) को बदलते हैं, जिससे क्राउन गॉल का निर्माण होता है। (ii) एक ओस (os) क्षेत्र जो असामान्य अमीनो एसिड (amino acid) या चीनी डेरिवेटिव (sugar derivatives) के संश्लेषण के लिए जिम्मेदार है, जिन्हें सामूहिक रूप से ओपिन (opines) नाम दिया गया है। ओपिन विभिन्न प्रकार के यौगिकों (compounds - जैसे आर्गिनिन + पाइरूवेट - arginine + pyruvate) से प्राप्त होते हैं, जो पौधे की कोशिकाओं में पाए जाते हैं। दो सबसे आम ओपिन ऑक्टोपाइन (octopine) और नोपालाइन (nopaline) हैं। ऑक्टोपाइन और नोपालाइन के संश्लेषण के लिए, संबंधित एंजाइम ऑक्टोपाइन सिंथेज़ (octopine synthase) और नोपालाइन सिंथेज़ (nopaline synthase) T-DNA द्वारा कोडित किए जाते हैं।
इस आधार पर कि क्या Ti प्लास्मिड ऑक्टोपाइन या नोपालाइन को एनकोड करता है, इसे ऑक्टोपाइन-प्रकार Ti प्लास्मिड (octopine-type Ti plasmid) या नोपालाइन-प्रकार Ti प्लास्मिड (nopaline-type Ti plasmid) के रूप में वर्णित किया जाता है। उच्च पौधों सहित कई जीव ओपिन का उपयोग करने में असमर्थ हैं, जिन्हें एग्रोबैक्टीरियम द्वारा प्रभावी ढंग से उपयोग किया जा सकता है। T-DNA क्षेत्र के बाहर, Ti प्लास्मिड में ऐसे जीन होते हैं जो ओपिन को अपचयित (catabolize) करते हैं, जिनका उपयोग कार्बन (carbon) और नाइट्रोजन (nitrogen) के स्रोत के रूप में किया जाता है। सभी Ti और Ri प्लास्मिड पर T-DNA क्षेत्र लगभग पूर्ण 25bp प्रत्यक्ष दोहराव अनुक्रमों (direct repeat sequences) से घिरे होते हैं, जो T-DNA स्थानांतरण के लिए आवश्यक हैं, और केवल सिस ओरिएंटेशन (cis orientation) में कार्य करते हैं। यह भी दिखाया गया है कि कोई भी DNA अनुक्रम, जो सही ओरिएंटेशन में इन 25bp रिपीट अनुक्रमों से घिरा हुआ है, उसे पौधे की कोशिकाओं में स्थानांतरित किया जा सकता है, एक ऐसा गुण जिसका उच्च पौधों में एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थ जीन स्थानांतरण के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है जिससे ट्रांसजेनिक पौधों का उत्पादन होता है।
25bp फ्लैंकिंग सीमा अनुक्रमों (flanking border sequences - T DNA के साथ) के अलावा, T-DNA स्थानांतरण के लिए vir क्षेत्र (vir region) भी आवश्यक है। जबकि सीमा अनुक्रम T-DNA के संबंध में सिस ओरिएंटेशन में कार्य करते हैं, vir क्षेत्र ट्रांस ओरिएंटेशन (trans orientation) में भी काम करने में सक्षम है। नतीजतन, T-DNA और vir क्षेत्र को दो अलग-अलग प्लास्मिड पर भौतिक रूप से अलग करने से T-DNA स्थानांतरण प्रभावित नहीं होता है, बशर्ते दोनों प्लास्मिड एक ही एग्रोबैक्टीरियम कोशिका में मौजूद हों। इस गुण ने उच्च पौधों में जीन स्थानांतरण के लिए वैक्टर डिजाइन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई, जैसा कि बाद में चर्चा की जाएगी। vir क्षेत्र (लगभग 35 kbp) छह ओपेरॉन (operons) में व्यवस्थित (organized) है, अर्थात् vir A, vir B, vir C, vir D, vir E, और vir G, जिनमें से चार ओपेरॉन (vir A और vir G को छोड़कर) पॉलीसिस्ट्रोनिक (polycistronic) हैं। जीन vir A, B, D, और G उग्रता के लिए बिल्कुल आवश्यक हैं; शेष दो जीन vir C और E ट्यूमर गठन के लिए आवश्यक हैं। vir A लोकस सभी स्थितियों में रचनात्मक रूप से (constitutively) व्यक्त किया जाता है।
vir G लोकस वनस्पति कोशिकाओं (vegetative cells) में निम्न स्तर पर व्यक्त होता है, लेकिन घायल पौधे के ऊतकों (wounded plant tissue) के स्राव (exudates) द्वारा तेजी से उच्च अभिव्यक्ति स्तरों के लिए प्रेरित होता है। vir A और vir G जीन उत्पाद अन्य vir लोकी की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करते हैं। vir A उत्पाद (Vir A) एग्रोबैक्टीरियम कोशिकाओं की आंतरिक झिल्ली (inner membrane) पर स्थित है और संभवतः एक केमोरिसेप्टर (chemoreceptor) है, जो फेनोलिक यौगिकों (phenolic compounds - घायल पौधों के ऊतकों के स्राव में पाया जाता है) की उपस्थिति को महसूस करता है, जैसे कि एसिटोसिरिंगोन (acetosyringone) और β-हाइड्रॉक्सीएसिटोसिरिंगोन (β-hydroxyaceto syringone)। संकेत पारगमन (Signal transduction) Vir G (जीन vir G का उत्पाद) की सक्रियता (activation - संभवतः फॉस्फोरिलेशन - phosphorylation) के माध्यम से आगे बढ़ता है, जो बदले में अन्य vir जीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है।
एग्रोबैक्टीरियम संक्रमण (Agrobacterium infection - वैक्टर के रूप में इसके प्लास्मिड का उपयोग) का उपयोग कई डिकोटाइलडोनस प्रजातियों (dicotyledonous species) में विदेशी DNA (foreign DNA) के हस्तांतरण के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है। एकमात्र महत्वपूर्ण प्रजाति जिसने अच्छी प्रतिक्रिया नहीं दी है, वे प्रमुख बीज फलियां (seed legumes) हैं, भले ही ट्रांसजेनिक सोयाबीन (Glycine max) पौधे प्राप्त किए गए हों। जीन स्थानांतरण के इस दृष्टिकोण में सफलता ऊतक संवर्धन प्रौद्योगिकी (tissue culture technology) में सुधार के परिणामस्वरूप हुई है। हालाँकि, मोनोकोटाइलडोन (monocotyledons) को एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता जीन स्थानांतरण के लिए सफलतापूर्वक उपयोग नहीं किया जा सका, सिवाय शतावरी (Asparagus) के एक एकमात्र उदाहरण के। इसके कारणों को पूरी तरह से नहीं समझा गया है, क्योंकि सेलुलर स्तर पर T-DNA का स्थानांतरण होता है। यह संभव है कि मोनोकॉट्स (monocots) में विफलता मोनोकोटाइलडोनस कोशिकाओं के घाव प्रतिक्रिया (wound response) की कमी में निहित है।
प्रत्यक्ष जीन स्थानांतरण विधियों में, रुचि के बहिर्जात जीन को वेक्टर की मदद के बिना परपोषी पौधे की कोशिका में पहुंचाया जाता है। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर वैक्टर (genetically engineered vectors) का उपयोग करके जीन स्थानांतरण प्रणाली विशेष रूप से मोनोकॉट (monocot) प्रजातियों में अच्छी तरह से काम नहीं करती है। समस्या को ध्यान में रखते हुए, प्रत्यक्ष जीन स्थानांतरण विधियों की कोशिश की गई है और पौधों में प्रत्यक्ष जीन स्थानांतरण के लिए उपयोग की जाने वाली विधियाँ हैं:
प्रोटोप्लास्ट द्वारा प्रत्यक्ष DNA तेज (Direct DNA uptake) को पॉलीइथाइलीन ग्लाइकोल (polyethylene glycol - PEG) जैसे रसायनों द्वारा उत्तेजित (stimulated) किया जा सकता है। यह विधि 1982 में क्रेन (Krens) और उनके सहयोगियों द्वारा बताई गई थी। यह तकनीक इतनी कुशल है कि लगभग हर प्रोटोप्लास्ट प्रणाली परिवर्तनशील (transformable) साबित हुई है। लिपोसोम (liposomes) के तेज को उत्तेजित करने और इलेक्ट्रोपोरेशन (electroporation) की दक्षता में सुधार करने के लिए भी PEG का उपयोग किया जाता है। उच्च सांद्रता (high concentration - 15-25%) पर PEG DNA जैसे आयनिक मैक्रोमोलेक्यूल्स (ionic macromolecules) को अवक्षेपित (precipitate) करेगा और प्रोटोप्लास्ट को किसी भी गंभीर क्षति के बिना एंडोसाइटोसिस (endocytosis) द्वारा उनके तेज को उत्तेजित करेगा। इसके बाद कोशिका भित्ति का निर्माण (cell wall formation) और कोशिका विभाजन (cell division) की शुरुआत होती है। इन कोशिकाओं को अब चयन माध्यम (selection medium) पर कम घनत्व (low density) पर प्लेट (plated) किया जा सकता है। उपरोक्त विधि का उपयोग करके प्रारंभिक अध्ययन पेटुनिया (Petunia) और निकोटियाना (Nicotiana) तक सीमित थे।
हालाँकि, अन्य पौधे प्रणालियों (चावल, मक्का, आदि) का भी बाद में सफलतापूर्वक उपयोग किया गया। इन विधियों में, PEG का उपयोग शुद्ध Ti प्लास्मिड के साथ संयोजन में किया गया था, या एक वाहक DNA (carrier DNA) के साथ मिश्रित कैल्शियम फॉस्फेट (calcium phosphate) अवक्षेपित Ti प्लास्मिड का उपयोग किया गया था। इस विधि से 100 में से 1 तक की परिवर्तन आवृत्तियाँ (transformation frequencies) प्राप्त की गई हैं। फिर भी, ट्रांसजेनिक पौधे प्राप्त करने के लिए इस पद्धति का उपयोग करने में गंभीर समस्याएं हैं और ये सभी समस्याएं प्रोटोप्लास्ट से पौधों के पुनर्जनन (plant regeneration) से संबंधित हैं।
रूपांतरित प्रोटोप्लास्ट (transformed protoplasts) से पौधों का पुनर्जनन, अभी भी एक समस्या बनी हुई है। इसलिए संवर्धित ऊतक (cultured tissues), जो अपरिपक्व संरचनाओं (immature structures) के निरंतर विकास को प्रोत्साहित करते हैं, परिवर्तन के लिए वैकल्पिक सेलुलर लक्ष्य (alternate cellular targets) प्रदान करते हैं। इन अपरिपक्व संरचनाओं में अपरिपक्व भ्रूण (immature embryos), मेरिस्टेम, अपरिपक्व पराग (immature pollen), अंकुरित पराग (germinating pollen), पृथक बीजांड (isolated ovules), भ्रूणजन्य निलंबन संवर्धित कोशिकाएं (embryogenic suspension cultured cells) आदि शामिल हो सकते हैं। इस तकनीक का मुख्य नुकसान पौधे के केवल एक हिस्से के परिवर्तन के साथ काइमेरिक पौधों (chimeric plants) का उत्पादन है। हालाँकि, इस काइमेरिक पौधे से, एकल कोशिका उत्पत्ति (single cell origin) के रूपांतरित पौधों को बाद में प्राप्त किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, तिलहन बलात्कार (oilseed rape - Brassica napus) में वास्तव में ट्रांसजेनिक काइमेरा (transgenic chimeras) प्राप्त किए गए हैं।
जब कोशिकाओं या प्रोटोप्लास्ट का उपयोग माइक्रोइंजेक्शन (microinjection) की तकनीक में लक्ष्य के रूप में किया जाता है, तो प्राप्तकर्ता कोशिका (recipient cell) या प्रोटोप्लास्ट के कोशिका द्रव्य (cytoplasm) या नाभिक (nucleus) में मैक्रोमोलेक्यूल्स (macromolecules) के हस्तांतरण के लिए 0.5-10μm व्यास की नोक (tip) वाले ग्लास माइक्रोपिपेट (glass micropipettes) का उपयोग किया जाता है। प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को एक ठोस समर्थन (solid support - कवर स्लिप या स्लाइड, आदि) पर स्थिर (immobilized) किया जाता है या कृत्रिम रूप से सब्सट्रेट (substrate) से बांधा जाता है या सक्शन (suction) के तहत पिपेट (pipette) द्वारा आयोजित किया जाता है (जैसा कि पशु प्रणालियों में किया जाता है)। अक्सर DNA को माइक्रोइंजेक्ट करने के लिए विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए माइक्रोमैनिपुलेटर (micromanipulator) का उपयोग किया जाता है। यद्यपि, यह तकनीक सफलता की उच्च दर देती है, लेकिन यह प्रक्रिया धीमी, महंगी है और इसके लिए अत्यधिक कुशल और अनुभवी कर्मियों (highly skilled and experienced personnel) की आवश्यकता होती है।
माइक्रोइंजेक्शन विधि 1986 में क्रॉस्वे (Crossway) और रीच (Reich) के नेतृत्व में वैज्ञानिक के दो समूहों द्वारा शुरू की गई थी। हाल ही में एक विधि जिसे "होल्डिंग पिपेट विधि (holding pipette method)" कहते हैं, शुरू की गई थी। इसमें, सेल सस्पेंशन कल्चर (cell suspension culture) से अलग किए गए प्रोटोप्लास्ट को DNA समाधान (DNA solution) के एक माइक्रोड्रोप्लेट (microdroplet) के साथ अपनी तरफ से एक डिप्रेशन स्लाइड (depression slide) पर रखा जाता है। होल्डिंग पिपेट का उपयोग करके, प्रोटोप्लास्ट को पकड़ना होता है और इंजेक्शन पिपेट (injection pipette) का उपयोग करके DNA को नाभिक में इंजेक्ट किया जाता है। माइक्रो इंजेक्शन के बाद इंजेक्ट की गई कोशिकाओं को हैंगिंग ड्रॉपलेट कल्चर विधि (hanging droplet culture method) द्वारा संवर्धित किया जाता है।
कोशिका के व्यास से अधिक व्यास वाली सुइयों को नियोजित करने वाले DNA मैक्रोइंजेक्शन (DNA macroinjection) का भी प्रयास किया गया है। राई (rye - Secale cereale) में, एक मार्कर जीन को अपरिपक्व पुष्प मेरिस्टेम (immature floral meristem) के नीचे तने (stem) में मैक्रोइंजेक्ट किया गया था, ताकि स्पोरोजीनस ऊतक (sporogenous tissue) तक पहुंचा जा सके (De la Pena et al., 1987) जिससे ट्रांसजेनिक पौधों का सफल उत्पादन हुआ। दुर्परिणति से, कई प्रयोगशालाओं में कोशिश किए जाने पर इस तकनीक को किसी अन्य अनाज (cereal) के साथ सफलतापूर्वक दोहराया नहीं जा सका। इसलिए, राई के साथ किए गए पहले के प्रयोगों (Potrykus, 1991) की वैधता (validity) के बारे में संदेह व्यक्त किया जाता है।
प्रोटोप्लास्ट में विदेशी DNA को शामिल करने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन एक और प्रभावी विधि है, और इस प्रकार पौधों में प्रत्यक्ष जीन स्थानांतरण (direct gene transfer) के लिए। यह विधि 1986 में फ्रोम (Fromm) और उनके सहकर्मियों द्वारा पेश की गई थी।
यह विधि उच्च क्षेत्र की शक्ति (high field strength) के छोटे विद्युत आवेगों (short electrical impulses) के उपयोग पर आधारित है। ये आवेग प्रोटोप्लास्ट झिल्ली (protoplast membrane) की पारगम्यता (permeability) को बढ़ाते हैं और यदि DNA झिल्ली के सीधे संपर्क में है तो कोशिकाओं में DNA अणुओं (DNA molecules) के प्रवेश को सुविधाजनक बनाते हैं। इसके मद्देनजर, प्रोटोप्लास्ट में DNA पहुंचाने के लिए, इलेक्ट्रोपोरेशन कुशल परिवर्तन के लिए कई नियमित तकनीकों (routine techniques) में से एक है। हालांकि, चूंकि प्रोटोप्लास्ट से पुनर्जनन हमेशा संभव नहीं होता है, इसलिए अक्सर संवर्धित कोशिकाओं या ऊतक एक्सप्लांट्स (tissue explants) का उपयोग किया जाता है। नतीजतन, यह परीक्षण करना महत्वपूर्ण है कि क्या इलेक्ट्रोपोरेशन दीवार वाली कोशिकाओं (walled cells) में जीन स्थानांतरित कर सकता है। इनमें से अधिकांश मामलों में परिवर्तन का कोई प्रमाण उपलब्ध नहीं था।
इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स (electroporation pulse) को विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए इलेक्ट्रोपोरेशन कक्ष (electroporation chamber) में इलेक्ट्रोड (electrodes) के पार संधारित्र (capacitor) का निर्वहन (discharging) करके उत्पन्न किया जाता है। या तो छोटी अवधि (short duration) के उच्च वोल्टेज (high voltage - 1.5 kV) आयताकार तरंग पल्स (rectangular wave pulse) या लंबी अवधि (long duration) के कम वोल्टेज (low voltage - 350V) पल्स का उपयोग किया जाता है। बाद वाले को एक घरेलू मशीन द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है। वेक्टर DNA (vector DNA) युक्त एक आयनिक घोल (ionic solution) में प्रोटोप्लास्ट इलेक्ट्रोड के बीच निलंबित (suspended) होते हैं, इलेक्ट्रोपोरेट (electroporated) किए जाते हैं और फिर हमेशा की तरह प्लेट किए जाते हैं। रूपांतरित कॉलोनियों (Transformed colonies) का चयन पहले बताए अनुसार किया जाता है। इलेक्ट्रोपोरेशन विधि का उपयोग करते हुए, तंबाकू, पेटुनिया, मक्का, चावल, गेहूं और ज्वार (sorghum) के प्रोटोप्लास्ट के साथ जीन का सफल स्थानांतरण प्राप्त किया गया था। इनमें से अधिकांश मामलों में उपयुक्त प्रमोटर अनुक्रम (promoter sequence) से जुड़े कैट (cat) जीन को स्थानांतरित कर दिया गया था। परिवर्तन आवृत्तियों में और सुधार किया जा सकता है (i) 1.25kV/cm की क्षेत्र शक्ति (field strength) का उपयोग करके, (ii) DNA जोड़ने के बाद PEG जोड़कर, DNA जोड़ने से पहले 5 मिनट के लिए \(45^\circ\text{C}\) पर प्रोटोप्लास्ट को हीट शॉकिंग (heat shocking) देकर और (iv) गोलाकार (circular) DNA के बजाय रैखिक (linear) का उपयोग करके।
1987 में, क्लेन (Klein) और उनके सहयोगियों ने एक ऐसी विधि विकसित की जिसके द्वारा बरकरार पौधे के अंगों (intact plant organs) या संवर्धित कोशिकाओं की कोशिकाओं में DNA की डिलीवरी प्रोजेक्टाइल बॉम्बार्डमेंट (Projectile Bombardment) नामक प्रक्रिया द्वारा की जाती है। माइक्रो-प्रोजेक्टाइल (micro-projectiles - छोटे उच्च घनत्व वाले कण - small high density particles) एक पार्टिकल गन उपकरण (particle gun apparatus) द्वारा उच्च वेग (high velocity) में त्वरित (accelerated) होते हैं। उच्च गतिज ऊर्जा (high kinetic energy) वाले ये कण कोशिकाओं और झिल्लियों में प्रवेश करते हैं और बमबारी की गई कोशिकाओं (bombarded cells) के अंदर विदेशी DNA ले जाते हैं। इस विधि को "बायोलिस्टिक्स विधि (Biolistics Method)" के रूप में भी जाना जाता है। हाल के वर्षों में, यह दिखाया गया है कि पौधों की कोशिकाओं में DNA वितरण (DNA delivery) भी संभव है, जब भारी माइक्रोपार्टिकल्स (टंगस्टन या सोना - tungsten or gold) को रुचि के DNA के साथ लेपित (coated) किया जाता है और बहुत उच्च प्रारंभिक वेग (1,400 फीट प्रति सेकंड) तक त्वरित किया जाता है। ये माइक्रोप्रोजेक्टाइल (microprojectiles), आमतौर पर व्यास में 1-3pm, एक 'मैक्रोप्रोजेक्टाइल (macroprojectile)' या 'बुलेट (bullet)' द्वारा ले जाए जाते हैं और जीवित पौधों की कोशिकाओं (लक्षित कोशिकाएं पराग, सुसंस्कृत कोशिकाएं, विभेदित ऊतकों और मेरिस्टेम में कोशिकाएं हो सकती हैं - target cells can be pollen, cultured cells, cells in differentiated tissues and meristems) में त्वरित हो जाते हैं ताकि वे बरकरार ऊतक (intact tissue) की कोशिका की दीवारों (cell walls) को भेद सकें। त्वरण (acceleration) या either एक विस्फोटक चार्ज (explosive charge - कॉर्डाइट विस्फोट - cordite explosion) द्वारा या उच्च वोल्टेज इलेक्ट्रिक डिस्चार्ज (high voltage electric discharge) द्वारा शुरू की गई शॉक वेव्स (shock waves) का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। माइक्रोप्रोजेक्टाइल के त्वरण के लिए उपयोग की जाने वाली दो पार्टिकल गन (particle guns) का डिज़ाइन।
जीन गन (Gene gun)
उपरोक्त तकनीक का उपयोग करके रूपांतरित पौधे सोयाबीन, तंबाकू, मक्का, चावल, गेहूं आदि सहित कई मामलों में प्राप्त किए गए हैं। इस विधि द्वारा कोशिकाओं में स्थानांतरित जीन की क्षणिक अभिव्यक्ति (Transient expression) प्याज, मक्का, चावल और गेहूं में भी देखी गई है। कोई अन्य जीन स्थानांतरण दृष्टिकोण नहीं है, जिसका इतने उत्साह के साथ स्वागत किया गया हो। नतीजतन, इस तकनीक के विकास के लिए प्रयोग (experimentation) और जनशक्ति (manpower) में काफी निवेश (investment) किया गया है।
सोनिकेशन विधि (Sonication Method): यह हाल ही में (1990) जू (Xu) और उनके सहकर्मियों द्वारा तैयार की गई एक सरल तकनीक है। इस विधि में एक्सप्लांट्स (विशेषकर पत्तियों) को काटकर खंडों (segments) में विभाजित किया जाता है, एक बाँझ कांच की पेट्रीडिश (sterile glass petridish) में प्लास्मिड DNA (plasmid DNA) और कैरियर DNA युक्त सोनिकेशन बफर (sonication buffer) में डुबोया (immersed) जाता है। फिर नमूनों (samples) को 30 मिनट के लिए \(0.5 \text{ c/cm}^2\) ध्वनिक तीव्रता (acoustic intensity) पर अल्ट्रासोनिक पल्स जनरेटर (ultrasonic pulse generator) के साथ सोनिकेट (sonicated) किया गया था। 30 मिनट के बाद, एक्सप्लांट्स को DMSO के बिना बफर समाधान (buffer solution) में धोया गया और कल्चर माध्यम (culture medium) में स्थानांतरित कर दिया गया।
इस विधि का उपयोग जीवाणु कोशिकाओं (bacterial cells) जैसे ई. कोलाई (E. coli) में विदेशी DNA को पेश करने के लिए किया जाता है। इस विधि में परिवर्तन आवृत्ति (transformation frequency - कोशिका आबादी का वह अंश जिसे स्थानांतरित किया जा सकता है) बहुत अच्छी है। उदाहरण के लिए ई. कोलाई द्वारा प्लास्मिड DNA का तेज बर्फ के ठंडे (ice cold) \(CaCl_2\) (\(0-5^\circ\text{C}\)) में किया जाता है, जिसके बाद लगभग 90 सेकंड के लिए \(37-45^\circ\text{C}\) पर हीट शॉक उपचार (heat shock treatment) किया जाता है। परिवर्तन दक्षता (transformation efficiency) जोड़े गए DNA के प्रति माइक्रोग्राम ट्रांसफॉर्मेंट्स (transformants) की संख्या को संदर्भित करती है। \(CaCl_2\) कुछ क्षेत्रों में कोशिका भित्ति (cell wall) को तोड़ता है और DNA को कोशिका की सतह (cell surface) से बांधता है।
यह एक प्राकृतिक माइक्रोबियल पुनर्संयोजन प्रक्रिया (natural microbial recombination process) है और इसका उपयोग जीन स्थानांतरण की एक विधि के रूप में किया जाता है। संयुग्मन में, दो जीवित बैक्टीरिया एक साथ आते हैं और सिंगल स्ट्रैंडेड DNA (single stranded DNA) को साइटोप्लाज्मिक ब्रिज (cytoplasmic bridges) के माध्यम से दाता बैक्टीरिया (donor bacteria) से प्राप्तकर्ता बैक्टीरिया (recipient bacteria) में स्थानांतरित किया जाता है।
लिपोसोम छोटे लिपिड बैग (lipid bags) होते हैं, जिनमें बड़ी संख्या में प्लास्मिड (plasmids) संलग्न होते हैं। उन्हें PEG जैसे उपकरणों का उपयोग करके प्रोटोप्लास्ट के साथ जुड़ने (fuse) के लिए प्रेरित किया जा सकता है, और इसलिए जीन स्थानांतरण के लिए उपयोग किया गया है। तकनीक, निम्नलिखित फायदे प्रदान करती है: (i) न्यूक्लीज पाचन (nuclease digestion) से DNA/RNA (DNA/RNA) की सुरक्षा, (ii) कम सेल विषाक्तता (low cell toxicity), लिपोसोम में एनकैप्सुलेशन (encapsulation) के कारण न्यूक्लिक एसिड (nucleic acids) की स्थिरता और भंडारण (storage), (iv) प्रजनन क्षमता (reproducibility) की उच्च डिग्री और (v) सेल प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए प्रयोज्यता (applicability)।
इस तकनीक में, DNA लिपोसोम के एंडोसाइटोसिस के कारण प्रोटोप्लास्ट में प्रवेश करता है, जिसमें निम्नलिखित चरण शामिल हैं: (i) प्रोटोप्लास्ट सतह पर लिपोसोम का आसंजन (adhesion), (ii) आसंजन स्थल (site of adhesion) पर लिपोसोम का संलयन (fusion) और कोशिका के अंदर प्लास्मिड की रिहाई (release)। इस तकनीक का सफलतापूर्वक पौधों की कई प्रजातियों (जैसे तंबाकू, पेटुनिया, गाजर, आदि) के प्रोटोप्लास्ट में DNA पहुंचाने के लिए उपयोग किया गया है।
ऐसी उम्मीद की गई है कि अंकुरित पराग द्वारा DNA लिया जा सकता है और या तो शुक्राणु नाभिक (sperm nuclei) में एकीकृत (integrate) हो सकता है या पराग नलिका मार्ग (pollen tube pathway) के माध्यम से युग्मनज तक पहुंच सकता है। इन दोनों दृष्टिकोणों की कोशिश की गई है और दिलचस्प फेनोटाइपिक परिवर्तनों (phenotypic alterations) से जीन स्थानांतरण का सुझाव मिला है। हालांकि, किसी भी मामले में, जीन स्थानांतरण का स्पष्ट प्रमाण (unequivocal proof) उपलब्ध नहीं हुआ है। कई प्रयोगों में, जब स्थानांतरण के लिए मार्कर जीन का उपयोग किया गया, तो केवल नकारात्मक परिणाम प्राप्त हुए। इस विधि में कई समस्याएं मौजूद हैं और इनमें कोशिका भित्ति, न्यूक्लिअस (nucleases), स्वीकर्ता DNA (acceptor DNA) की हेटेरोक्रोमैटिक अवस्था (heterochromatic state), पराग नलिका में कैलोज़ प्लग (callose plugs) आदि शामिल हैं। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके ट्रांसजेनिक पौधों को कभी भी प्राप्त नहीं किया गया है और यह विधि, यद्यपि बहुत आकर्षक है, जीन स्थानांतरण के लिए बहुत कम क्षमता रखती है।
विदेशी DNA को \(Ca^{++}\) आयनों के साथ भी ले जाया जा सकता है, जो कैल्शियम फॉस्फेट के रूप में कैल्शियम (calcium) के अवक्षेपण (precipitation) के कारण कोशिका के अंदर जारी किया जा सकता है। अतीत में, इस विधि को पौधों में जीन स्थानांतरण के लिए बहुत महत्वपूर्ण माना जाता था।
ज्ञात DNA (वायरल या गैर वायरल जिसमें परिभाषित मार्कर जीन होते हैं - viral or non viral having defined marker genes) में सूखे बीज (dry seeds), भ्रूण, ऊतकों (tissues) या कोशिकाओं (cells) का ऊष्मायन (Incubation) कई मामलों में आजमाया गया है और परिभाषित जीनों की अभिव्यक्ति देखी गई है। हालांकि, किसी भी मामले में एकीकृत परिवर्तन (integrative transformation) का प्रमाण उपलब्ध नहीं हो सका। इन सभी मामलों में, पौधे की कोशिका भित्ति (plant cell walls) न केवल कुशल बाधाओं (efficient barriers) के रूप में काम करती है, बल्कि DNA अणुओं के लिए कुशल जाल (efficient traps) भी हैं। यह बहुत आश्चर्यजनक होगा यदि DNA पीईजी (PEG) द्वारा, या इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा या किसी अन्य उपकरण द्वारा उन्हें पारगम्य (permeabilizing) किए बिना कोशिका भित्ति को कुशलता से पार कर सके।
पादप आनुवंशिक इंजीनियरिंग (plant genetic engineering) में गैर-रूपांतरित कोशिकाओं (untransformed cells) से रूपांतरित पौधों की कोशिकाओं (transformed plant cells) का चयन एक महत्वपूर्ण कदम है। इसके लिए, एक उपयुक्त चयन माध्यम (selection medium - एंटीबायोटिक युक्त) के चयन के बाद ट्रांसजीन (transgene) के साथ पौधे में एक मार्कर जीन (marker gene - उदा. एंटीबायोटिक प्रतिरोध के लिए) पेश किया जाता है। बाद की पीढ़ियों में ट्रांसजीन एकीकरण (transgene integration) और अभिव्यक्ति (expression) के अलगाव (segregation) और स्थिरता (stability) का अध्ययन आनुवंशिक और आणविक विश्लेषण (Northern, Southern, Western blot, PCR) द्वारा किया जा सकता है।
यद्यपि नग्न DNA (naked DNA) का उपयोग करके जीन स्थानांतरण के लिए कई विधियों का वर्णन किया गया है, आनुवंशिक पुनर्संयोजकों (genetic recombinants) की वसूली (recovery), जिन्हें अन्यथा "ट्रांसजेनिक पौधों" कहते हैं, एक दुर्लभ घटना (rare phenomenon) प्रतीत होती है। एक ठोस प्रयास (concerted effort):
पिछले पांच वर्षों में सफल परिणाम देखे गए हैं और वेक्टर मध्यस्थता (vector mediated) और प्रत्यक्ष जीन स्थानांतरण दोनों तकनीकों का उपयोग करके कुछ फसल प्रजातियों में ट्रांसजेनिक पौधों का उत्पादन किया गया है। हालांकि, एकीकृत जीन स्थानांतरण (integrative gene transfer) के प्रमाणों की कमी के कारण सभी कार्यक्रम सफल नहीं हुए। एकीकृत जीन स्थानांतरण के लिए आवश्यकताओं को ध्यान में रखते हुए, पोट्रीकस (Potrykus) बताते हैं कि सभी सफल जीन स्थानांतरण में निम्नलिखित प्रमाण होने चाहिए:
अतिरिक्त पठन (Additional reading)…
http://www.biotechnology4u.com/plant_biotechnology_gene_transfermethods_plants.html
http://depts.washington.edu/agro/
http://www.ejbiotechnology.info/content/vol1/issue3/full/1/bip/
http://arabidopsis.info/students/agrobacterium/
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