ब्लॉटिंग (Blotting) वह तकनीक है जिसमें न्यूक्लिक एसिड (nucleic acids) या प्रोटीन को एक ठोस आधार (solid support), आमतौर पर नायलॉन (nylon) या नाइट्रोसेल्युलोज मेम्ब्रेन (nitrocellulose membranes) पर स्थिर (immobilized) किया जाता है। न्यूक्लिक एसिड की ब्लॉटिंग संकरण अध्ययन (hybridization studies) के लिए मुख्य तकनीक है। मेम्ब्रेन पर न्यूक्लिक एसिड की लेबलिंग (labeling) और संकरण (hybridization) ने जीन अभिव्यक्ति (gene expression), संगठन (organization) आदि को समझने से जुड़ी प्रयोगात्मक तकनीकों की एक शृंखला का आधार बनाया है।
रक्त (blood) जैसे जटिल जैविक मिश्रणों (complex biological mixtures) में विशिष्ट प्रोटीन (specific proteins) की पहचान करना और मापना लंबे समय से वैज्ञानिक और नैदानिक अभ्यास (diagnostic practice) में महत्वपूर्ण लक्ष्य रहे हैं। हाल ही में, जीनोमिक DNA (genomic DNA) में असामान्य जीन (abnormal genes) की पहचान नैदानिक अनुसंधान (clinical research) और आनुवंशिक परामर्श (genetic counseling) में तेजी से महत्वपूर्ण हो गई है। ब्लॉटिंग तकनीकों का उपयोग अद्वितीय प्रोटीन (unique proteins) और न्यूक्लिक एसिड अनुक्रमों (nucleic acid sequences) की पहचान करने के लिए किया जाता है। उन्हें अत्यधिक विशिष्ट (highly specific) और संवेदनशील (sensitive) बनाने के लिए विकसित किया गया है और वे आणविक जीव विज्ञान (molecular biology) और नैदानिक अनुसंधान दोनों में महत्वपूर्ण उपकरण बन गए हैं।
ब्लॉटिंग विधियां (blotting methods) काफी सरल हैं और आमतौर पर इनमें चार अलग-अलग चरण होते हैं: नमूने में प्रोटीन या न्यूक्लिक एसिड के टुकड़ों (fragments) का इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण (electrophoretic separation); पेपर सपोर्ट पर स्थानांतरण (transfer) और स्थिरीकरण (immobilization); पेपर पर लक्ष्य अणु (target molecule) से विश्लेषणात्मक जांच (analytical probe) का जुड़ना (binding); और बंधे हुए जांच (bound probe) का दृश्यीकरण (visualization)। एक नमूने में अणुओं को पहले वैद्युतकणसंचलन (electrophoresis) द्वारा अलग किया जाता है और फिर आसानी से संभाले जाने वाले सपोर्ट माध्यम (support medium) या मेम्ब्रेन (membrane) पर स्थानांतरित किया जाता है। यह प्रोटीन या DNA (DNA) के टुकड़ों को स्थिर करता है, मूल पृथक्करण की एक वफादार प्रतिकृति (replica) प्रदान करता है, और बाद के जैव रासायनिक विश्लेषण (biochemical analysis) की सुविधा प्रदान करता है। सपोर्ट माध्यम में स्थानांतरित होने के बाद, स्थिर प्रोटीन या न्यूक्लिक एसिड टुकड़े को जांच (probes), जैसे कि एंटीबॉडी (antibodies) या DNA के उपयोग द्वारा स्थानीयकृत (localized) किया जाता है, जो विशेष रूप से रुचि के अणु (molecule of interest) से जुड़ते हैं। अंत में, स्थिर लक्ष्य अणु से बंधे जांच की स्थिति को आमतौर पर ऑटोरेडियोग्राफी (autoradiography) द्वारा देखा जाता है। तीन मुख्य ब्लॉटिंग तकनीकें विकसित की गई हैं और इन्हें आमतौर पर साउदर्न (Southern), नॉर्दर्न (northern) और वेस्टर्न ब्लॉटिंग (western blotting) कहा जाता है।
साउदर्न ब्लॉट एक DNA नमूने (DNA sample) में DNA अनुक्रम (DNA sequence) की उपस्थिति की जांच करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधि है। इस विधि का नाम इसके आविष्कारक, ब्रिटिश जीवविज्ञानी एडविन साउदर्न (Edwin Southern) के नाम पर रखा गया है।
साउदर्न ब्लॉट तकनीक की प्रक्रिया नीचे विस्तार से दी गई है:
फ़िल्टर मेम्ब्रेन पर एक विशिष्ट DNA टुकड़े (specific DNA fragment) से जांच का संकरण यह दर्शाता है कि इस टुकड़े में DNA अनुक्रम है जो जांच का पूरक (complementary) है। वैद्युतकणसंचलन जेल (electrophoresis gel) से मेम्ब्रेन में DNA का स्थानांतरण चरण लेबल की गई संकरण जांच को आकार-विभाजित DNA (size-fractionated DNA) से आसानी से जुड़ने की अनुमति देता है। प्रतिबंध एंजाइम-पचे हुए जीनोमिक DNA (restriction enzyme-digested genomic DNA) के साथ किए गए साउदर्न ब्लॉट (Southern blots) का उपयोग जीनोम (genome) में अनुक्रमों (sequences) (जैसे, जीन प्रतियां (gene copies)) की संख्या निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। एक जांच जो केवल एक एकल DNA खंड (single DNA segment) से संकरित (hybridizes) होती है जिसे प्रतिबंध एंजाइम (restriction enzyme) द्वारा नहीं काटा गया है, साउदर्न ब्लॉट पर एक एकल बैंड (single band) का उत्पादन करेगी, जबकि कई बैंड (multiple bands) देखे जाने की संभावना है जब जांच कई अत्यधिक समान अनुक्रमों (highly similar sequences) (जैसे, जो अनुक्रम दोहराव (sequence duplication) का परिणाम हो सकते हैं) से संकरित होती है। संकरण की स्थिति (hybridization conditions) (अर्थात्, संकरण तापमान को बढ़ाना या नमक की सांद्रता (salt concentration) को कम करना) के संशोधन (Modification) का उपयोग विशिष्टता (specificity) को बढ़ाने और उन अनुक्रमों के लिए जांच के संकरण को कम करने के लिए किया जा सकता है जो 100% से कम समान हैं।
नॉर्दर्न ब्लॉट तकनीक (northern blot technique) का उपयोग एक नमूने में RNA (RNA) (या पृथक mRNA (isolated mRNA)) का पता लगाकर जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। नॉर्दर्न ब्लॉटिंग के साथ विभेदन (differentiation), मॉर्फोजेनेसिस (morphogenesis), साथ ही असामान्य या रोगग्रस्त स्थितियों (abnormal or diseased conditions) के दौरान विशेष जीन अभिव्यक्ति स्तरों (gene expression levels) का निर्धारण करके संरचना (structure) और कार्य (function) पर सेलुलर नियंत्रण (cellular control) का निरीक्षण करना संभव है। यह तकनीक 1977 में स्टैनफोर्ड यूनिवर्सिटी में जेम्स अलवाइन (James Alwine), डेविड केम्प (David Kemp) और जॉर्ज स्टार्क (George Stark) द्वारा विकसित की गई थी। नॉर्दर्न ब्लॉटिंग को इसका नाम पहली ब्लॉटिंग तकनीक, साउदर्न ब्लॉट के साथ इसकी समानता से मिलता है। मुख्य अंतर यह है कि नॉर्दर्न ब्लॉट में DNA के बजाय RNA का विश्लेषण किया जाता है।
ब्लॉटिंग प्रक्रिया एक समरूप ऊतक नमूने (homogenized tissue sample) से कुल RNA (total RNA) के निष्कर्षण (extraction) से शुरू होती है। पॉली(ए) टेल (poly(A) tail) वाले केवल उन्हीं RNA को बनाए रखने के लिए ओलिगो (डीटी) सेल्युलोज क्रोमैटोग्राफी (oligo (dT) cellulose chromatography) के उपयोग के माध्यम से एमRNA (mRNA) को अलग किया जा सकता है। फिर RNA नमूनों को जेल वैद्युतकणसंचलन (gel electrophoresis) द्वारा अलग किया जाता है। नॉर्दर्न ब्लॉटिंग में उपयोग के लिए एक सकारात्मक चार्ज वाली नायलॉन मेम्ब्रेन (nylon membrane) सबसे प्रभावी है क्योंकि नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए न्यूक्लिक एसिड (negatively charged nucleic acids) का उनके प्रति उच्च आकर्षण (high affinity) होता है। ब्लॉटिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले ट्रांसफर बफर (transfer buffer) में आमतौर पर फॉर्मामाइड (formamide) होता है क्योंकि यह जांच-RNA इंटरैक्शन (probe-RNA interaction) के एनीलिंग तापमान (annealing temperature) को कम करता है जिससे उच्च तापमान द्वारा RNA का क्षरण (RNA degradation) रुकता है। एक बार जब RNA को मेम्ब्रेन में स्थानांतरित कर दिया जाता है तो इसे यूवी प्रकाश (UV light) या गर्मी द्वारा मेम्ब्रेन में सहसंयोजक बंधन (covalent linkage) के माध्यम से स्थिर कर दिया जाता है। जांच को लेबल (labeled) किए जाने के बाद, इसे मेम्ब्रेन पर RNA से संकरित (hybridized) किया जाता है। यह सुनिश्चित करने के लिए मेम्ब्रेन को धोया जाता है कि जांच विशेष रूप से बंधी है (bound specifically)। संकर संकेतों (hybrid signals) का पता तब एक्स-रे फिल्म द्वारा लगाया जाता है और डेन्सिटोमेट्री (densitometry) द्वारा परिमाणित (quantified) किया जा सकता है।
नॉर्दर्न ब्लॉटिंग ऊतकों (tissues), अंगों (organs), विकास के चरणों (developmental stages), पर्यावरणीय तनाव के स्तर (environmental stress levels), रोगज़नक़ संक्रमण (pathogen infection) के बीच किसी विशेष जीन के अभिव्यक्ति प्रतिरूप (expression pattern) को देखने की अनुमति देता है। इस तकनीक का उपयोग 'सामान्य' ऊतक की तुलना में कैंसर कोशिकाओं (cancerous cells) में ऑन्कोजीन (oncogenes) की अति अभिव्यक्ति (over expression) और ट्यूमर-दबाने वाले जीन (tumor-suppressor genes) के डाउन रेगुलेशन (down regulation) को दिखाने के लिए किया गया है, साथ ही प्रत्यारोपित अंगों (transplanted organs) की अस्वीकृति (rejection) में जीन अभिव्यक्ति को दिखाने के लिए भी किया गया है। यदि नॉर्दर्न ब्लॉट पर एमRNA की प्रचुरता (abundance of mRNA) द्वारा एक अप-रेगुलेटेड जीन (up regulated gene) देखा जाता है तो यह निर्धारित करने के लिए नमूने को अनुक्रमित (sequenced) किया जा सकता है कि क्या जीन शोधकर्ताओं को ज्ञात है या यदि यह एक नई खोज (novel finding) है। दी गई परिस्थितियों में प्राप्त अभिव्यक्ति प्रतिरूप (expression patterns) उस जीन के कार्य के बारे में अंतर्दृष्टि (insight) प्रदान कर सकते हैं। चूंकि RNA को पहले आकार के आधार पर अलग किया जाता है, यदि केवल एक जांच प्रकार (probe type) का उपयोग किया जाता है तो मेम्ब्रेन पर प्रत्येक बैंड के स्तर में भिन्नता (variance) उत्पाद के आकार में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, जो एक ही जीन या दोहराव अनुक्रम रूपांकनों (repetitive sequence motifs) के वैकल्पिक स्प्लिस उत्पादों (alternative splice products) का सुझाव देती है। जीन उत्पाद (gene product) के आकार में भिन्नता ट्रांसक्रिप्ट प्रसंस्करण (transcript processing) में विलोपन (deletions) या त्रुटियों (errors) का भी संकेत दे सकती है, ज्ञात अनुक्रम (known sequence) के साथ उपयोग किए गए जांच लक्ष्य (probe target) को बदलकर यह निर्धारित करना संभव है कि RNA का कौन सा क्षेत्र गायब है।
जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण कई अलग-अलग तरीकों से किया जा सकता है जिनमें RT-PCR, RNase सुरक्षा परख (RNase protection assays), माइक्रोएरे (microarrays), जीन अभिव्यक्ति का सीरियल विश्लेषण (serial analysis of gene expression - SAGE), साथ ही नॉर्दर्न ब्लॉटिंग (northern blotting) शामिल हैं। माइक्रोएरे का उपयोग आमतौर पर किया जाता है और आमतौर पर नॉर्दर्न ब्लॉट से प्राप्त डेटा के अनुरूप होते हैं, हालांकि कभी-कभी नॉर्दर्न ब्लॉटिंग जीन अभिव्यक्ति में उन छोटे बदलावों का पता लगाने में सक्षम होता है जिन्हें माइक्रोएरे नहीं कर सकते हैं। नॉर्दर्न ब्लॉट पर माइक्रोएरे का जो लाभ है वह यह है कि एक ही समय में हजारों जीनों की कल्पना की जा सकती है जबकि नॉर्दर्न ब्लॉटिंग आमतौर पर एक या कुछ जीनों को देख रहा है। नॉर्दर्न ब्लॉटिंग में एक समस्या अक्सर RNases (नमूने के लिए अंतर्जात (endogenous) और पर्यावरण प्रदूषण (environmental contamination) दोनों के माध्यम से) द्वारा नमूना क्षरण (sample degradation) होती है, जिसे कांच के बने पदार्थ (glassware) के उचित नसबंदी (sterilization) और DEPC (डायथाइलपायरोकार्बोनेट - diethylpyrocarbonate) जैसे RNase अवरोधकों (RNase inhibitors) के उपयोग से बचा जा सकता है। अधिकांश नॉर्दर्न ब्लॉट में उपयोग किए जाने वाले रसायन शोधकर्ता के लिए एक जोखिम (risk) हो सकते हैं, क्योंकि फॉर्मेल्डिहाइड (formaldehyde), रेडियोधर्मी सामग्री (radioactive material); एथिडियम ब्रोमाइड (ethidium bromide), DEPC, और UV प्रकाश सभी कुछ निश्चित जोखिमों (exposures) के तहत हानिकारक हैं। RT-PCR की तुलना में नॉर्दर्न ब्लॉटिंग में कम संवेदनशीलता (low sensitivity) होती है लेकिन इसमें उच्च विशिष्टता (high specificity) भी होती है जो झूठे सकारात्मक (false positive) परिणामों को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। नॉर्दर्न ब्लॉटिंग के उपयोग के लाभों में RNA आकार (RNA size) का पता लगाना, वैकल्पिक स्प्लिस उत्पादों (alternate splice products) का अवलोकन, आंशिक समरूपता (partial homology) वाले जांच का उपयोग, ब्लॉटिंग से पहले जेल पर RNA की गुणवत्ता (quality) और मात्रा (quantity) को मापा जा सकता है, और ब्लॉटिंग के बाद वर्षों तक मेम्ब्रेन को संग्रहीत (stored) और फिर से जांचा (reprobed) जा सकता है।
प्रक्रिया का एक प्रकार जिसे रिवर्स नॉर्दर्न ब्लॉट कहते हैं, कभी-कभी उपयोग किया जाता है। इस प्रक्रिया में, सब्सट्रेट न्यूक्लिक एसिड (substrate nucleic acid) (जो मेम्ब्रेन पर चिपका होता है) पृथक DNA टुकड़ों (isolated DNA fragments) का एक संग्रह होता है, और जांच एक ऊतक (tissue) से निकाला गया और रेडियोधर्मी रूप से लेबल (radioactively labelled) किया गया RNA है। DNA माइक्रोएरे (DNA microarrays) का उपयोग जो 1990 के दशक के अंत और 2000 के दशक की शुरुआत में व्यापक उपयोग में आया है, वह रिवर्स प्रक्रिया (reverse procedure) के अधिक समान है, जिसमें वे एक सब्सट्रेट (substrate) से जुड़े पृथक DNA टुकड़ों के उपयोग और सेलुलर RNA (cellular RNA) से बने जांच के साथ संकरण को शामिल करते हैं। इस प्रकार रिवर्स प्रक्रिया, हालांकि मूल रूप से असामान्य थी, ने नॉर्दर्न विश्लेषण (northern analysis) को जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग (gene expression profiling) में विकसित करने में सक्षम बनाया, जिसमें एक जीव (organism) के कई (संभवतः सभी) जीनों की अभिव्यक्ति की निगरानी (expression monitored) की जा सकती है।
वेस्टर्न ब्लॉट (वैकल्पिक रूप से, इम्युनोब्लॉट (immunoblot)) का उपयोग ऊतक समरूप (tissue homogenate) या अर्क (extract) के दिए गए नमूने में विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने के लिए किया जाता है। यह विधि स्टैनफोर्ड (Stanford) में जॉर्ज स्टार्क की प्रयोगशाला से उत्पन्न हुई। डब्ल्यू. नील बर्नेट (W. Neal Burnette) द्वारा तकनीक को वेस्टर्न ब्लॉट नाम दिया गया था।
नमूने पूरे ऊतक (whole tissue) या कोशिका संवर्धन (cell culture) से लिए जा सकते हैं। ज्यादातर मामलों में, ठोस ऊतकों (solid tissues) को पहले एक ब्लेंडर (blender) (बड़े नमूने की मात्रा के लिए), होमोजेनाइज़र (homogenizer) (छोटी मात्रा) या सोनिकेशन (sonication) का उपयोग करके यंत्रवत् (mechanically) तोड़ा जाता है। कोशिकाओं के लसीका (lysis) को प्रोत्साहित करने और प्रोटीन को घुलनशील (solubilize) करने के लिए विभिन्न डिटर्जेंट (detergents), लवण (salts) और बफर (buffers) को नियोजित किया जा सकता है। प्रोटेज़ (Protease) और फॉस्फेटेस अवरोधक (phosphatase inhibitors) अक्सर नमूने को अपने स्वयं के एंजाइमों द्वारा पचाने से रोकने के लिए जोड़े जाते हैं। प्रोटीन विकृतीकरण (protein denaturing) से बचने के लिए अक्सर ठंडे तापमान (cold temperatures) पर ऊतक की तैयारी की जाती है। विभिन्न सेल डिब्बों (cell compartments) और ऑर्गेनेल (organelles) को अलग करने के लिए विभिन्न प्रकार के निस्पंदन (filtration) और सेंट्रीफ्यूजेशन (centrifugation) सहित जैव रासायनिक (biochemical) और यांत्रिक (mechanical) तकनीकों के संयोजन का उपयोग किया जा सकता है।
नमूने के प्रोटीन को जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके अलग किया जाता है। प्रोटीन का पृथक्करण आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु (isoelectric point - pI), आणविक भार (molecular weight), विद्युत चार्ज (electric charge) या इन कारकों के संयोजन द्वारा हो सकता है। SDS-PAGE (SDS पॉलीएक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस - SDS polyacrylamide gel electrophoresis) पॉलीपेप्टाइड्स (polypeptides) को विकृत अवस्था (denatured state) में बनाए रखता है जब उन्हें द्वितीयक (secondary) और तृतीयक (tertiary) संरचना को हटाने के लिए मजबूत कम करने वाले एजेंटों (strong reducing agents) के साथ इलाज किया जाता है और इस प्रकार उनके आणविक भार के अनुसार प्रोटीन के पृथक्करण की अनुमति देता है। नमूना प्रोटीन नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए SDS में ढके हो जाते हैं और जेल के एक्रिलामाइड जाल (acrylamide mesh) के माध्यम से सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए इलेक्ट्रोड (positively charged electrode) की ओर बढ़ते हैं। छोटे प्रोटीन इस जाल के माध्यम से तेजी से पलायन (migrate) करते हैं और इस प्रकार प्रोटीन आकार (size) के अनुसार अलग हो जाते हैं। एक्रिलामाइड की एकाग्रता (concentration) जेल के रिज़ॉल्यूशन (resolution) को निर्धारित करती है - एक्रिलामाइड की एकाग्रता जितनी अधिक होगी, कम आणविक भार प्रोटीन का रिज़ॉल्यूशन उतना ही बेहतर होगा। एक्रिलामाइड सांद्रता जितनी कम होगी, उच्च आणविक भार प्रोटीन का रिज़ॉल्यूशन उतना ही बेहतर होगा। अधिकांश ब्लॉट के लिए प्रोटीन जेल के साथ केवल एक आयाम (one dimension) में यात्रा करते हैं।
नमूनों को जेल में कुओं (wells) में लोड किया जाता है। एक लेन आमतौर पर एक मार्कर (marker) या सीढ़ी (ladder) के लिए आरक्षित (reserved) होती है, जो परिभाषित आणविक भार (defined molecular weights) वाले प्रोटीन का व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मिश्रण है, आमतौर पर दाग (stained) होता है ताकि दृश्यमान, रंगीन बैंड (visible, coloured bands) बन सकें। जब जेल के साथ वोल्टेज (voltage) लागू किया जाता है, तो प्रोटीन अलग-अलग गति (different speeds) से इसमें पलायन करते हैं। उन्नति की ये अलग-अलग दरें प्रत्येक लेन के भीतर बैंड (bands) में अलग हो जाती हैं। दो-आयामी (two-dimensional - 2-D) जेल का उपयोग करना भी संभव है जो एकल नमूने (single sample) से प्रोटीन को दो आयामों में फैलाता है। प्रोटीन को पहले आयाम में आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु (isoelectric point) (pH जिस पर उनका तटस्थ शुद्ध आवेश (neutral net charge) होता है) के अनुसार अलग किया जाता है, और दूसरे आयाम में उनके आणविक भार के अनुसार।
प्रोटीन को एंटीबॉडी का पता लगाने (antibody detection) के लिए सुलभ बनाने के लिए, उन्हें जेल के भीतर से नाइट्रोसेल्युलोज या पॉलीविनाइलिडीन डिफ्लोराइड (polyvinylidene difluoride - PVDF) मेम्ब्रेन पर साउदर्न ब्लॉट DNA स्थानांतरण (Southern blot DNA transfer) के समान ले जाया जाता है। प्रोटीन को स्थानांतरित करने की एक अन्य विधि को इलेक्ट्रो ब्लॉटिंग (electro blotting) कहा जाता है और प्रोटीन को जेल से PVDF या नाइट्रोसेल्युलोज मेम्ब्रेन में खींचने के लिए विद्युत प्रवाह (electric current) का उपयोग किया जाता है। प्रोटीन जेल के भीतर उस संगठन को बनाए रखते हुए जेल के भीतर से मेम्ब्रेन पर जाते हैं जो उनके पास जेल के भीतर था। इस "ब्लॉटिंग" प्रक्रिया के परिणामस्वरूप, प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक पतली सतह परत (thin surface layer) पर उजागर (exposed) होते हैं। प्रोटीन बंधन (Protein binding) हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन (hydrophobic interactions) के साथ-साथ मेम्ब्रेन और प्रोटीन के बीच चार्ज किए गए इंटरैक्शन (charged interactions) पर आधारित है। नाइट्रोसेल्युलोज मेम्ब्रेन PVDF की तुलना में सस्ती होती हैं, लेकिन बहुत अधिक नाजुक (fragile) होती हैं और बार-बार जांचने (repeated probings) के लिए अच्छी तरह से खड़ी नहीं होती हैं। जेल से मेम्ब्रेन में प्रोटीन के स्थानांतरण की एकरूपता (uniformity) और समग्र प्रभावशीलता (overall effectiveness) को कूमैसी (Coomassie) या पोंसेउ एस डाई (Ponceau S dyes) के साथ मेम्ब्रेन को दाग (staining) कर जांचा जा सकता है। पोंसेउ एस दोनों में से अधिक सामान्य है, पोंसेउ एस की उच्च संवेदनशीलता (higher sensitivity) और पानी में घुलनशीलता (water solubility) के कारण यह बाद में मेम्ब्रेन को डिस्टेन (destain) और जांचना आसान बनाता है।
चूंकि मेम्ब्रेन को प्रोटीन से जुड़ने की क्षमता के लिए चुना गया है और एंटीबॉडी और लक्ष्य (target) दोनों प्रोटीन हैं, इसलिए मेम्ब्रेन और लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के बीच इंटरैक्शन (interactions) को रोकने के लिए कदम उठाए जाने चाहिए। गैर-विशिष्ट बंधन (non-specific binding) का ब्लॉकिंग मेम्ब्रेन को प्रोटीन के पतला घोल (dilute solution) में रखकर प्राप्त किया जाता है - आमतौर पर बोवाइन सीरम एल्बुमिन (Bovine serum albumin - BSA) या गैर-वसा वाला सूखा दूध (non-fat dry milk) (दोनों सस्ते हैं), डिटर्जेंट (detergent) जैसे ट्विन 20 (Tween 20) के एक मिनट प्रतिशत (minute percentage) के साथ। पतला घोल में प्रोटीन मेम्ब्रेन से उन सभी स्थानों पर जुड़ जाता है जहां लक्ष्य प्रोटीन नहीं जुड़े हैं। इस प्रकार, जब एंटीबॉडी जोड़ा जाता है, तो इसके लिए मेम्ब्रेन पर विशिष्ट लक्ष्य प्रोटीन के बाध्यकारी साइटों (binding sites) के अलावा जुड़ने (attach) के लिए कोई जगह नहीं होती है। यह वेस्टर्न ब्लॉट के अंतिम उत्पाद में "शोर" (noise) को कम करता है, स्पष्ट परिणाम (clearer results) देता है, और झूठे सकारात्मक (false positives) को समाप्त करता है.
पहचान प्रक्रिया (detection process) के दौरान मेम्ब्रेन को रुचि के प्रोटीन (protein of interest) के लिए एक संशोधित एंटीबॉडी (modified antibody) के साथ "जांच" (probed) किया जाता है जो एक रिपोर्टर एंजाइम (reporter enzyme) से जुड़ा होता है, जो उचित सब्सट्रेट के संपर्क में आने पर एक रंगमितीय प्रतिक्रिया (colourimetric reaction) चलाता है और एक रंग (colour) पैदा करता है। कई कारणों से, यह पारंपरिक रूप से दो-चरणीय प्रक्रिया (two-step process) में होता है, हालांकि अब कुछ अनुप्रयोगों के लिए एक-चरणीय पहचान विधियां (one-step detection methods) उपलब्ध हैं।
ऐतिहासिक रूप से, प्राथमिक (primary) और द्वितीयक एंटीबॉडी (secondary antibodies) को अलग-अलग प्रक्रियाओं में उत्पादित करने में आसानी के कारण प्रोबिंग प्रक्रिया (probing process) दो चरणों में की जाती थी। यह शोधकर्ताओं और निगमों को लचीलेपन (flexibility) के मामले में भारी लाभ देता है, और पहचान प्रक्रिया में एक प्रवर्धन कदम (amplification step) जोड़ता है। उच्च थ्रूपुट प्रोटीन विश्लेषण (high-throughput protein analysis) के आगमन और पहचान की निचली सीमा (lower limits of detection) को देखते हुए, हालांकि, एक-चरणीय प्रोबिंग सिस्टम (one-step probing systems) विकसित करने में रुचि रही है जो प्रक्रिया को तेजी से और कम उपभोग्य सामग्रियों (consumables) के साथ होने देगी। इसके लिए एक जांच एंटीबॉडी (probe antibody) की आवश्यकता होती है जो रुचि के प्रोटीन को पहचानता है और उसमें एक पता लगाने योग्य लेबल (detectable label) होता है, जो अक्सर ज्ञात प्रोटीन टैग (known protein tags) के लिए उपलब्ध होता है। प्राथमिक जांच को मेम्ब्रेन के साथ दो-चरणीय प्रक्रिया में प्राथमिक एंटीबॉडी के समान तरीके से इनक्यूबेट किया जाता है, और फिर वाश स्टेप्स (wash steps) की एक श्रृंखला के बाद प्रत्यक्ष पहचान (direct detection) के लिए तैयार होता है।
बिना बाउंड जांच को धोए जाने के बाद, वेस्टर्न ब्लॉट उन जांचों का पता लगाने के लिए तैयार है जो लेबल हैं और रुचि के प्रोटीन से बंधे हैं। व्यावहारिक शब्दों में, सभी वेस्टर्न ब्लॉट मेम्ब्रेन में केवल एक बैंड पर प्रोटीन प्रकट नहीं करते हैं। वैद्युतकणसंचलन के दौरान लोड किए गए मार्कर या सीढ़ी के दागदार बैंड (stained bands) की तुलना करके आकार अनुमान (Size approximations) लिया जाता है। संरचनात्मक प्रोटीन (structural protein), जैसे कि एक्टिन (actin) या ट्यूबुलिन (tubulin), जो नमूनों के बीच नहीं बदलना चाहिए, के लिए प्रक्रिया दोहराई जाती है। समूहों के बीच नियंत्रण के लिए लक्ष्य प्रोटीन की मात्रा को संरचनात्मक प्रोटीन के साथ अनुक्रमित (indexed) किया जाता है। यह अभ्यास त्रुटियों या अपूर्ण स्थानान्तरण (incomplete transfers) के मामले में मेम्ब्रेन पर कुल प्रोटीन की मात्रा के लिए सुधार (correction) सुनिश्चित करता है।
रंगमिति (colorimetric) पहचान विधि एक सब्सट्रेट के साथ वेस्टर्न ब्लॉट के ऊष्मायन (incubation) पर निर्भर करती है जो द्वितीयक एंटीबॉडी से बंधे रिपोर्टर एंजाइम (जैसे पेरोक्सीडेज - peroxidase) के साथ प्रतिक्रिया करता है। यह घुलनशील डाई (soluble dye) को एक अलग रंग के अघुलनशील रूप (insoluble form) में परिवर्तित करता है जो एंजाइम के बगल में अवक्षेपित (precipitates) होता है और इस प्रकार मेम्ब्रेन को दागता (stains) है। ब्लॉट का विकास तब घुलनशील डाई को धोकर रोक दिया जाता है। प्रोटीन के स्तर का मूल्यांकन डेन्सिटोमेट्री (दाग कितना तीव्र है) या स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री (spectrophotometry) के माध्यम से किया जाता है।
केमिलुमिनसेंट पहचान विधियाँ एक सब्सट्रेट के साथ वेस्टर्न ब्लॉट के ऊष्मायन पर निर्भर करती हैं जो द्वितीयक एंटीबॉडी पर रिपोर्टर (reporter) के संपर्क में आने पर चमक (luminesce) उत्पन्न करेगी। प्रकाश का पता तब फोटोग्राफिक फिल्म द्वारा लगाया जाता है, और हाल ही में CCD कैमरों (CCD cameras) द्वारा जो वेस्टर्न ब्लॉट की एक डिजिटल छवि (digital image) कैप्चर करते हैं। छवि का विश्लेषण डेन्सिटोमेट्री द्वारा किया जाता है, जो प्रोटीन धुंधला (protein staining) की सापेक्ष मात्रा (relative amount) का मूल्यांकन करता है और ऑप्टिकल घनत्व (optical density) के संदर्भ में परिणामों को मापता है। नया सॉफ्टवेयर आगे के डेटा विश्लेषण (data analysis) की अनुमति देता है जैसे कि आणविक भार विश्लेषण (molecular weight analysis) यदि उचित मानकों (appropriate standards) का उपयोग किया जाता है।
रेडियोधर्मी लेबल (Radioactive labels) को एंजाइम सबस्ट्रेट्स (enzyme substrates) की आवश्यकता नहीं होती है, बल्कि सीधे वेस्टर्न ब्लॉट के खिलाफ चिकित्सा एक्स-रे फिल्म (medical X-ray film) को रखने की अनुमति देते हैं जो लेबल के संपर्क में आने पर विकसित होता है और अंधेरे क्षेत्र (dark regions) बनाता है जो रुचि के प्रोटीन बैंड (protein bands) के अनुरूप होते हैं। रेडियोधर्मी पहचान विधियों का महत्व कम हो रहा है, क्योंकि यह बहुत महंगा (expensive) है, स्वास्थ्य और सुरक्षा जोखिम (health and safety risks) अधिक हैं और ECL एक उपयोगी विकल्प प्रदान करता है।
फ्लोरोसेंट रूप से लेबल की गई जांच (fluorescently labeled probe) प्रकाश द्वारा उत्तेजित (excited) होती है और उत्तेजना के उत्सर्जन (emission) का पता फिर एक फोटोसेंसर (photosensor) द्वारा लगाया जाता है जैसे कि उचित उत्सर्जन फिल्टर (emission filters) से सुसज्जित CCD कैमरा जो वेस्टर्न ब्लॉट की एक डिजिटल छवि कैप्चर करता है और आणविक भार विश्लेषण और एक मात्रात्मक वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण (quantitative western blot analysis) जैसे आगे के डेटा विश्लेषण की अनुमति देता है। ब्लॉटिंग विश्लेषण के लिए फ्लोरेसेंस (Fluorescence) को सबसे संवेदनशील पता लगाने के तरीकों में से एक माना जाता है।
नाइट्रोसेल्युलोज और PVDF मेम्ब्रेन के बीच एक बड़ा अंतर एंटीबॉडी को "स्ट्रिपिंग" (stripping) करने और बाद के एंटीबॉडी जांच के लिए मेम्ब्रेन का पुन: उपयोग करने की क्षमता से संबंधित है। जबकि नाइट्रोसेल्युलोज मेम्ब्रेन को छीलने के लिए अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल (protocols) उपलब्ध हैं, मजबूत PVDF आसान स्ट्रिपिंग की अनुमति देता है, और पृष्ठभूमि शोर (background noise) प्रयोगों को सीमित करने से पहले अधिक पुन: उपयोग (reuse) के लिए। एक और अंतर यह है कि, नाइट्रोसेल्युलोज के विपरीत, PVDF को उपयोग करने से पहले 95% इथेनॉल (ethanol), आइसोप्रोपेनॉल (isopropanol) या मेथनॉल (methanol) में भिगोना चाहिए। उपयोग के दौरान PVDF मेम्ब्रेन भी अधिक मोटी (thicker) और क्षति (damage) के प्रति अधिक प्रतिरोधी (resistant) होती है।
2-आयामी SDS-PAGE ऊपर उल्लिखित सिद्धांतों और तकनीकों का उपयोग करता है। 2-D SDS-PAGE, जैसा कि नाम से पता चलता है, में 2 आयामों (2 dimensions) में पॉलीपेप्टाइड्स का प्रवासन (migration) शामिल है। उदाहरण के लिए, पहले आयाम में पॉलीपेप्टाइड्स को आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु के अनुसार अलग किया जाता है, जबकि दूसरे आयाम में पॉलीपेप्टाइड्स को उनके आणविक भार के अनुसार अलग किया जाता है। किसी दिए गए प्रोटीन का आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु सकारात्मक (positively) (जैसे लाइसिन - lysine और आर्जिनिन - arginine) और नकारात्मक रूप से (negatively) (जैसे ग्लूटामेट - glutamate और एस्पार्टेट - aspartate) चार्ज किए गए अमीनो एसिड (amino acids) की सापेक्ष संख्या (relative number) द्वारा निर्धारित किया जाता है, जिसमें नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए अमीनो एसिड उच्च आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु में योगदान करते हैं और सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए अमीनो एसिड कम आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु में योगदान करते हैं। नमूनों को पहले SDS-PAGE का उपयोग करके गैर-घटाने वाली स्थितियों (nonreducing conditions) के तहत अलग किया जा सकता है और दूसरे आयाम में स्थितियों को कम करने (reducing conditions) के तहत, जो डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड (disulfide bonds) को अलग करता है जो सबयूनिट्स (subunits) को एक साथ रखते हैं। 2-आयामी जेल के लिए SDS-PAGE को यूरिया-PAGE (urea-PAGE) के साथ भी जोड़ा जा सकता है।
सिद्धांत रूप में, यह विधि एक बड़े जेल (single large gel) पर सभी सेलुलर प्रोटीन (cellular proteins) को अलग करने की अनुमति देती है। इस विधि का एक प्रमुख लाभ यह है कि यह अक्सर किसी विशेष प्रोटीन के विभिन्न आइसोफॉर्म (isoforms) के बीच अंतर करता है - उदाहरण के लिए एक प्रोटीन जिसे फॉस्फोराइलेट (phosphorylated) किया गया है (नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए समूह को जोड़कर)। अलग किए गए प्रोटीन को जेल से काटा जा सकता है और फिर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (mass spectrometry) द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, जो प्रोटीन की पहचान करता है।
यह प्रोटीन पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधन (protein post translational modification) का पता लगाने की एक तकनीक है और वेस्टर्न ब्लॉटिंग की जैव रासायनिक तकनीक (biochemical technique) का विस्तार (extension) है। दो आयामी (two dimensional) SDS-PAGE जेल से PVDF या नाइट्रोसेल्युलोज मेम्ब्रेन पर ब्लॉट किए गए प्रोटीन का विश्लेषण पोस्ट-ट्रांसलेशनल प्रोटीन संशोधनों (post-translational protein modifications) के लिए लिपिड (lipids), कार्बोहाइड्रेट (carbohydrate), फॉस्फो-मोइटीज़ (phospho-moieties) या किसी अन्य प्रोटीन संशोधन का पता लगाने के लिए विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए जांच का उपयोग करके किया जाता है।
इस तकनीक को एर्लिचिया (Ehrlichia) की दो प्रजातियों - ई. मुरिस (E. muris) और आईओई (IOE) में प्रोटीन संशोधनों का पता लगाने के लिए विकसित किया गया था। हैजा विष बी सबयूनिट (Cholera toxin B subunit) (जो लिपिड का पता लगाता है), कॉनकैनावलिन ए (Concanavalin A) (जो ग्लूकोज मोइटीज़ (glucose moieties) का पता लगाता है) और नाइट्रोफॉस्फो मोलिब्डेट-मिथाइल ग्रीन (nitrophospho molybdate-methyl green) (फॉस्फोप्रोटीन (phosphoproteins) का पता लगाता है) का उपयोग प्रोटीन संशोधनों का पता लगाने के लिए किया गया था। तकनीक से पता चला कि गैर-विषैले (non-virulent) ई. मुरिस (E. muris) के एंटीजेनिक प्रोटीन (antigenic proteins) अत्यधिक विषैले (highly virulent) आईओई की तुलना में पोस्ट-ट्रांसलेशनल रूप से अधिक संशोधित (post-translationally modified) हैं।
इस तकनीक की अवधारणा एस. थॉमस (S. Thomas) ने सैंडल स्पाइक फाइटोप्लाज्मा (sandal spike phytoplasma) पर काम करते हुए की थी और इसे intracellular बैक्टीरिया, एर्लिचिया पर काम करते हुए गैल्वेस्टन, टेक्सास में यूनिवर्सिटी ऑफ टेक्सास मेडिकल ब्रांच (University of Texas Medical Branch) के पैथोलॉजी विभाग (Dept. of Pathology) में विकसित किया गया था।
mRNA से अनुवादित (translated) अधिकांश प्रोटीन कोशिकाओं में कार्यात्मक (functional) होने से पहले संशोधनों (modifications) से गुजरते हैं। संशोधनों को सामूहिक रूप से, पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (post-translational modifications - PTMs) कहलाता है। नवजात (nascent) या मुड़े हुए (folded) प्रोटीन, जो शारीरिक स्थितियों (physiological conditions) के तहत स्थिर (stable) होते हैं, तब साइड चेन (side chains) या बैकबोन (backbones) पर विशिष्ट एंजाइम-उत्प्रेरित (enzyme-catalyzed) संशोधनों की एक बैटरी (battery) के अधीन होते हैं।
पोस्ट-ट्रांसलेशनल प्रोटीन संशोधनों में शामिल हैं: एसिटिलेशन (acetylation), एसाइलेशन (acylation) (मिरिस्टोइलेशन - myristoylation, पाल्मिटॉयलेशन - palmitoylation), एल्केलेशन (alkylation), आर्जिनिलेशन (arginylation), बायोटिनिलेशन (biotinylation), फॉर्माइलेशन (formylation), ग्लूटामिलेशन (glutamylation), ग्लाइकोसिलेशन (glycosylation), ग्लाइसीलेशन (glycylation), हाइड्रॉक्सिलेशन (hydroxylation), आइसोप्रेनलाइलेशन (isoprenylation), लिपोइलेशन (lipoylation), मिथाइलेशन (methylation), नाइट्रोअल्काइलेशन (nitroalkylation), फॉस्फोपेंटेथेनाइलेशन (phosphopantetheinylation), फॉस्फोराइलेशन (phosphorylation), प्रेनलाइलेशन (prenylation), सेलेनेशन (selenation), एस-नाइट्रोसिलेशन (S-nitrosylation), सल्फेशन (sulfation), ट्रांसग्लूटामिनेशन (transglutamination) और यूबिक्विटिनेशन (सुमोइलेशन) (ubiquitination (sumoylation))।
अमीनो एसिड श्रृंखला (amino acid chain) के एन-टर्मिनस (N-terminus) पर होने वाले पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन जैविक झिल्ली (biological membranes) के पार स्थानांतरण (translocation) में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इनमें प्रोकैरियोट्स (prokaryotes) और यूकेरियोट्स (eukaryotes) में स्रावी प्रोटीन (secretory proteins) और वे प्रोटीन भी शामिल हैं जो लाइसोसोम (lysosomes), क्लोरोप्लास्ट (chloroplast), माइटोकॉन्ड्रिया (mitochondria) और प्लाज्मा मेम्ब्रेन (plasma membranes) जैसे विभिन्न सेलुलर (cellular) और ऑर्गेनेल मेम्ब्रेन (organelle membranes) में शामिल होने के लिए अभिप्रेत (intended) हैं। कई बीमारियों में पोस्ट ट्रांसलेटेड प्रोटीन (post translated proteins) की अभिव्यक्ति महत्वपूर्ण है।
ब्लॉटिंग तकनीकों की कमियों ने डॉट ब्लॉटिंग तकनीक (dot blotting technique) के विकास को जन्म दिया है जो अधिक उन्नत (advanced), कम समय लेने वाली (less time consuming), सटीक (accurate) है और एक साथ जीन/स्रोत (gene/source) की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू (applicable) है।
विश्लेषण (analysing) के लिए डॉट (dot) या स्लॉट ब्लॉटिंग तकनीक (slot blotting technique) सभी तकनीकों में सबसे अधिक उपयोग की जाती है। ब्लॉटिंग विधियों में से किसी को भी ब्लॉटिंग और संकरण से पहले वैद्युतकणसंचलन की आवश्यकता नहीं होती है। इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण के बिना क्लोन किए गए DNA (cloned DNA) के संकरण को डॉट ब्लॉटिंग (dot blotting) कहा जाता है।
यह विधि पहली बार ग्रैनस्टिन्स (Granstiens) और हॉगनेस (Hogness) (1975) द्वारा विकसित की गई थी। इस विधि का उपयोग यह पहचानने के लिए किया जाता है कि बैक्टीरिया (bacteria) के किस कॉलोनी (colony) में हजारों के बीच रुचि का DNA (DNA of interest) है। इस प्रक्रिया में, स्क्रीन (screened) किए जाने वाले जीवाणु कालोनियों (bacterial colonies) को रेप्लिका प्लेटिंग (replica plating) का उपयोग करके नाइट्रोसेल्युलोज या नायलॉन मेम्ब्रेन पर स्थानांतरित (transferred) किया जाता है।
कोशिका की सतह (cell surface) के नकारात्मक चार्ज के कारण, कुछ कोशिकाएं नाइट्रोसेल्युलोज मेम्ब्रेन (nitrocellulose membrane) से जुड़ जाती हैं। फिर मेम्ब्रेन को कोशिका की सतह को तोड़ने, dsDNA को ssDNA में बदलने और DNA को मेम्ब्रेन से बांधने के लिए 0.5 N \(NaOH\) के घोल में रखा जाता है। बाद में, मेम्ब्रेन को न्यूट्रलाइज़ेशन सॉल्यूशन (neutralization solution) के साथ न्यूट्रलाइज़ (neutralizing) करने के बाद प्रोटीज़ सॉल्यूशन (protease solution) युक्त घोल में स्थानांतरित कर दिया जाता है।
DNA को या तो यूवी क्रॉस लिंकिंग (UV cross linking) या ओवन बेकिंग (oven baking) द्वारा मेम्ब्रेन पर कसकर तय (fixed) किया जाता है। इस मेम्ब्रेन का उपयोग जांच के साथ संकरण के लिए किया जाता है और सकारात्मक संकरण (positive hybridization) के लिए ऑटोरेडियोग्राफी या बायोटिन विधि (biotin method) का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है। एक कॉलोनी जिसका DNA प्रिंट (DNA print) (चूंकि रेप्लिका प्लेटिंग मेम्ब्रेन पर मास्टर प्लेट कॉलोनी (master plate colony) का एक रेप्लिका प्रिंट (replica print) प्रदान करता है) एक सकारात्मक संकरण देता है, उसे मास्टर प्लेट (master plate) से चुना जा सकता है।
प्लाक ब्लॉटिंग (Plaque blotting) कॉलोनी ब्लॉटिंग (colony blotting) के समान है; एकमात्र अंतर यह है कि जीवाणु कॉलोनी (bacterial colony) के बजाय, एक प्लाक (plaque) मेम्ब्रेन पर स्थानांतरित किया जाता है। बेंटन (Benton) और डेविस (Davis) ने इस पद्धति को 1977 में विकसित किया था। इस पद्धति का सबसे बड़ा फायदा यह है कि बैक्टीरिया/प्लाक युक्त एक एकल मास्टर प्लेट (single master plate) से कई समान DNA प्रिंट (identical DNA prints) आसानी से बनाए जा सकते हैं जिन्हें बनाया जाना है।
इस विधि का व्यापक रूप से विभिन्न प्रकार के जांच के खिलाफ एक एकल कोशिका प्रकार (single cell type) से DNA को संकरित (hybridize) करने के लिए उपयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, एक वायरल संक्रमण (viral infection) के लिए जिसे सामान्य पारंपरिक तरीकों (normal conventional methods) से पहचाना नहीं जा सकता है या यदि हम जानना चाहते हैं कि एकल कोशिका प्रकार (जैसे मस्तिष्क कोशिका - brain cell) में कौन से जीन (genes) व्यक्त (expressed) होते हैं।
सेल का प्रकार (Cell type) या जिन कोशिकाओं की जांच की जानी है, उन्हें पंक्तियों (rows) और स्तंभों (columns) के क्रम में मेम्ब्रेन पर 'डॉट' के रूप में रखा जाता है। फिर कोशिकाओं को एंजाइम (enzymes) या डिटर्जेंट (SDS) का उपयोग करके विकृत (denatured) किया जाता है और DNA को यूवी-क्रॉस लिंक (UV - cross link) या ओवन बेकिंग का उपयोग करके तय किया जाता है। इस मेम्ब्रेन का उपयोग तब जांच (जो एक जीन के लिए विशिष्ट हैं) का उपयोग करके संकरण के लिए किया जाता है।
आपकी एक राय से हम इन नोट्स को और बेहतर बना सकते हैं। कृपया नीचे रेटिंग दें।
Agrigyan को सभी विद्यार्थियों के लिए और बेहतर बनाने में मदद करने के लिए धन्यवाद।