मार्कर असिस्टेड सिलेक्शन और फसल सुधार (Marker Assisted Selection and Crop Improvement)

मार्कर असिस्टेड सिलेक्शन (Marker assisted selection) या मार्कर एडेड सिलेक्शन (MAS) एक ऐसी प्रक्रिया है जिसमें किसी मार्कर (आकारिकीय, जैव रासायनिक या DNA/RNA भिन्नता पर आधारित) का उपयोग किसी वांछित गुण (यानी उत्पादकता, रोग प्रतिरोधक क्षमता, अजैविक तनाव सहिष्णुता, और/या गुणवत्ता) के आनुवंशिक निर्धारक या निर्धारकों के अप्रत्यक्ष चयन (indirect selection) के लिए किया जाता है। इस प्रक्रिया का उपयोग पौधों और जानवरों के प्रजनन (breeding) में किया जाता है।

जैव प्रौद्योगिकी (Biotechnology) में हुए महत्वपूर्ण विकास ने पादप प्रजनकों को पारंपरिक फेनोटाइपिक-वंशावली-आधारित चयन (phenotypic-pedigree-based selection) प्रणालियों को बदलने के लिए अधिक कुशल चयन प्रणाली विकसित करने के लिए प्रेरित किया है।

मार्कर असिस्टेड सिलेक्शन एक अप्रत्यक्ष चयन प्रक्रिया है जहाँ किसी वांछित गुण का चयन स्वयं उस गुण के आधार पर नहीं बल्कि उससे जुड़े मार्कर के आधार पर किया जाता है। उदाहरण के लिए, यदि MAS का उपयोग किसी बीमारी वाले व्यक्तियों का चयन करने के लिए किया जा रहा है, तो बीमारी के स्तर को नहीं मापा जाता है, बल्कि बीमारी से जुड़े मार्कर एलील (allele) का उपयोग बीमारी की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए किया जाता है। यह माना जाता है कि जुड़ा हुआ एलील वांछित जीन (gene) और/या मात्रात्मक गुण बिंदु (Quantitative trait locus - QTL) के साथ जुड़ता है। MAS उन गुणों के लिए उपयोगी हो सकता है जिन्हें मापना मुश्किल है, जिनमें कम आनुवंशिकता (heritability) होती है, और/या जो विकास में देर से प्रकट होते हैं।

मार्कर के प्रकार (Marker types)

मार्कर निम्नलिखित प्रकार के हो सकते हैं:

• आकारिकीय (Morphological): ये पहले उपलब्ध मार्कर लोकस (loci) हैं जिनका पौधे के आकार (morphology) पर स्पष्ट प्रभाव पड़ता है। ऐसे जीन जो आकार, रंग, नर बंध्यता (male sterility) या प्रतिरोधक क्षमता को प्रभावित करते हैं, कई पौधों की प्रजातियों में उनका विश्लेषण किया गया है। इस प्रकार के मार्कर के उदाहरणों में धान में बाल (awn) की उपस्थिति या अनुपस्थिति, पत्ती के आवरण का रंग, ऊंचाई, अनाज का रंग, सुगंध आदि शामिल हो सकते हैं। मक्का, टमाटर, मटर, जौ या गेहूं जैसी अच्छी तरह से पहचानी जाने वाली फसलों में, ऐसे दसियों या यहां तक कि सैकड़ों जीनों को अलग-अलग गुणसूत्रों (chromosomes) पर निर्दिष्ट किया गया है।
• जैव रासायनिक (Biochemical): एक जीन जो एक प्रोटीन को एनकोड करता है जिसे निकाला और देखा जा सकता है; उदाहरण के लिए, आइसोजाइम (isozymes) और स्टोरेज प्रोटीन।
• कोशिकीय (Cytological): विभिन्न दागों (stains) द्वारा निर्मित गुणसूत्रीय बैंडिंग (chromosomal banding); उदाहरण के लिए, जी बैंडिंग (G banding)।
• जैविक (Biological): परपोषी रोगजनक (host pathogen) या परपोषी परजीवी संपर्क के आधार पर विभिन्न रोगजनक नस्लों या कीट बायोटाइप का उपयोग मार्कर के रूप में किया जा सकता है क्योंकि किसी जीव का आनुवंशिक संगठन रोगजनकों या परजीवियों के प्रति उसकी संवेदनशीलता को प्रभावित कर सकता है।
• DNA-आधारित और/या आणविक (DNA-based and/or molecular): वांछित जीन या लोकस के निकट होने वाले एक अद्वितीय (DNA अनुक्रम) को विभिन्न प्रकार की आणविक तकनीकों जैसे RFLPs, RAPDs, AFLP, DAF, SCARs, माइक्रोसैटेलाइट (microsatellites) आदि द्वारा पहचाना जा सकता है।

सैक्स (Sax) ने 1923 में पहली बार पौधों में मात्रात्मक गुण (quantitative trait) के साथ एक साधारण वंशानुक्रम में मिले आनुवंशिक मार्कर के जुड़ाव की सूचना दी थी, जब उन्होंने बीन्स (Phaseolus vulgaris L.) में बीज कोट रंग मार्कर के लिए अलगाव (segregation) के साथ बीज के आकार का अलगाव देखा था। रासमुसन (Rasmusson) ने 1935 में मटर में फूल आने के समय (एक मात्रात्मक गुण) का फूलों के रंग के लिए एक साधारण वंशानुक्रम में मिले जीन के साथ जुड़ाव प्रदर्शित किया।

जीन बनाम मार्कर (Gene vs marker)

वांछित जीन सीधे तौर पर प्रोटीन के उत्पादन से संबंधित होता है जो कुछ फेनोटाइप (phenotypes) उत्पन्न करते हैं, जबकि मार्कर को वांछित गुण को प्रभावित नहीं करना चाहिए बल्कि वे आनुवंशिक रूप से जुड़े होते हैं (और इसलिए मार्कर और वांछित जीन के बीच समजात पुनर्संयोजन (homologous recombination) में सहवर्ती कमी के कारण युग्मकों (gametes) के अलगाव के दौरान एक साथ जाते हैं)। कई गुणों में जीन खोजे जाते हैं और उनके मौजूद होने के लिए उच्च स्तर के विश्वास के साथ सीधे परख (assayed) की जा सकती है। हालांकि, यदि जीन को अलग (isolated) नहीं किया गया है, तो किसी वांछित जीन को टैग करने के लिए मार्कर की मदद ली जाती है। ऐसे मामले में रुचि के मार्कर और जीन (या QTL) के बीच पुनर्संयोजन के कारण कुछ गलत सकारात्मक (false positive) परिणाम हो सकते हैं। एक आदर्श मार्कर कोई गलत सकारात्मक परिणाम नहीं देगा।

MAS के लिए आदर्श मार्करों के महत्वपूर्ण गुण (Important properties of ideal markers for MAS)

एक आदर्श मार्कर में निम्नलिखित गुण होते हैं:

• सभी विभिन्न एलील्स से सभी संभावित फेनोटाइप्स (होमो और हेटेरोजाइगोट्स) की आसान पहचान।
• जीव के विकास की शुरुआत में ही, गुण के प्रकारों और/या वांछित जीन एलील्स के बीच अभिव्यक्ति में मापने योग्य अंतर प्रदर्शित करता है।
• वांछित गुण पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है जो मार्कर लोकस पर एलील के आधार पर भिन्न होता है।
• मार्करों के बीच कम या शून्य परस्पर क्रिया (interaction) जिससे एक अलग होने वाली आबादी (segregating population) में एक ही समय में कई का उपयोग किया जा सकता है।
• संख्या में प्रचुर मात्रा में (Abundant in number)।
• बहुरूपी (Polymorphic)।

आकारिकीय मार्करों के दोष (Demerits of morphological markers)

आकारिकीय मार्कर कई सामान्य कमियों से जुड़े होते हैं जो उनकी उपयोगिता को कम करते हैं, जिनमें शामिल हैं:

• जीव के विकास में देर तक मार्कर अभिव्यक्ति (expression) में देरी।
• प्रभाविता (Dominance)।
• हानिकारक प्रभाव (Deleterious effects)।
• प्लियोट्रॉपी (Pleiotropy)।
• वांछित जीन या गुण से असंबंधित जीनों के भ्रामक प्रभाव (confounding effects) लेकिन जो आकारिकीय मार्कर (एपिस्टेसिस - epistasis) को भी प्रभावित करते हैं।
• दुर्लभ बहुरूपता (Rare polymorphism)।
• पर्यावरणीय कारकों के अक्सर भ्रामक प्रभाव जो जीव की आकारिकीय विशेषताओं को प्रभावित करते हैं।

आकारिकीय मार्करों के विशिष्ट समस्याओं से बचने के लिए, DNA-आधारित मार्कर विकसित किए गए हैं। वे अत्यधिक बहुरूपी, सरल वंशागति (अक्सर सह-प्रभावी या codominant), पूरे जीनोम में प्रचुर मात्रा में पाए जाते हैं, खोजने में आसान और तेज़ होते हैं, न्यूनतम प्लियोट्रोपिक प्रभाव होता है और खोज जीव के विकास के चरण पर निर्भर नहीं करती है। धान, गेहूं, मक्का, सोयाबीन और कई अन्य सहित कई फसलों में विभिन्न गुणसूत्रों में कई मार्करों को मैप किया गया है। उन मार्करों का उपयोग विविधता विश्लेषण (diversity analysis), पितृत्व का पता लगाने (parentage detection), DNA फिंगरप्रिंटिंग और संकर प्रदर्शन (hybrid performance) की भविष्यवाणी में किया गया है। आणविक मार्कर अप्रत्यक्ष चयन प्रक्रियाओं में उपयोगी होते हैं, जिससे आगे के प्रसार के लिए व्यक्तियों के मैन्युअल चयन में सक्षम होते हैं।

मार्करों से जुड़े प्रमुख जीनों के लिए चयन (Selection for major genes linked to markers)

आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण विशेषताओं के लिए जिम्मेदार प्रमुख जीन प्लांट किंगडम में अक्सर पाए जाते हैं। ऐसी विशेषताओं में रोग प्रतिरोध, नर बंध्यता, स्व-असंगति (self-incompatibility) शामिल हैं; अन्य पूरे पौधों के आकार, रंग और वास्तुकला से संबंधित हैं और अक्सर प्रकृति में मोनो- या ओलिगोजेनिक (mono- or oligogenic) होते हैं। मार्कर लोकस जो प्रमुख जीनों से मजबूती से जुड़े होते हैं, उनका उपयोग चयन के लिए किया जा सकता है और कभी-कभी लक्ष्य जीन के प्रत्यक्ष चयन की तुलना में अधिक कुशल होते हैं। दक्षता में ऐसे लाभ उदाहरण के लिए, ऐसे मामलों में मार्कर mRNA की उच्च अभिव्यक्ति के कारण हो सकते हैं जहां मार्कर वास्तव में एक जीन है। वैकल्पिक रूप से, ऐसे मामलों में जहां ब्याज का लक्ष्य जीन दो एलील के बीच पता लगाने में मुश्किल एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (single nucleotide polymorphism) से भिन्न होता है, एक बाहरी मार्कर (चाहे वह एक और जीन हो या एक बहुरूपता जिसका पता लगाना आसान हो, जैसे कि एक छोटा टैंडेम रिपीट - short tandem repeat) सबसे यथार्थवादी विकल्प के रूप में उपस्थित हो सकता है।

ऐसी स्थितियां जो आणविक मार्कर चयन के लिए अनुकूल हैं (Situations that are favorable for molecular marker selection)

आनुवंशिक लक्षण के चयन में आणविक मार्करों के उपयोग के लिए कई संकेत (indications) हैं।
ऐसी स्थितियों में जहां:

• चयनित लक्षण पौधे के विकास में देर से व्यक्त होता है, जैसे फलों और फूलों की विशेषताएं या किशोर अवधि (juvenile period) वाले वयस्क लक्षण (ताकि प्रसार की व्यवस्था करने से पहले जीव के पूरी तरह से विकसित होने का इंतजार करना आवश्यक न हो)।
• लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति अप्रभावी (recessive) है (ताकि वे व्यक्ति जो अप्रभावी एलील के लिए हेटेरोजाइगस सकारात्मक हैं, उन्हें वांछित लक्षण के साथ कुछ होमोजाइगस (homozygous) संतानों का उत्पादन करने के लिए पार (cross) किया जा सके)।
• लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति को उत्पन्न करने के लिए विशेष परिस्थितियों की उपस्थिति की आवश्यकता होती है, जैसा कि रोग और कीट प्रतिरोध के लिए प्रजनन के मामले में (जहां अन्यथा रोग के साथ टीकाकरण या कीटों के अधीनता की आवश्यकता होगी)। यह लाभ अविश्वसनीय टीकाकरण विधियों के कारण होने वाली त्रुटियों और इस तथ्य से प्राप्त होता है कि सुरक्षा कारणों से कई क्षेत्रों में रोगज़नक़ के साथ क्षेत्र टीकाकरण की अनुमति नहीं है। इसके अलावा, पर्यावरण की दृष्टि से अस्थिर जीनों की मान्यता में आने वाली समस्याओं से बचा जा सकता है।
• फेनोटाइप दो या अधिक गैर-जुड़े (unlinked) जीनों (एपिस्टेसिस) से प्रभावित होता है। उदाहरण के लिए, जीन पिरामिडिंग (gene pyramiding) के लिए बीमारियों या कीटों के खिलाफ प्रतिरोध प्रदान करने वाले कई जीनों का चयन।

जीनोटाइपिंग (genotyping - आणविक मार्कर परख का एक उदाहरण) की लागत कम हो रही है जबकि फेनोटाइपिंग (phenotyping) की लागत विशेष रूप से विकसित देशों में बढ़ रही है, इस प्रकार तकनीक के विकास के साथ MAS का आकर्षण बढ़ रहा है।

MAS के लिए कदम (Steps for MAS)

आमतौर पर पहला कदम विभिन्न तकनीकों का उपयोग करके वांछित जीन या मात्रात्मक गुण बिंदु (QTL) को मैप करना है और फिर इस जानकारी का उपयोग मार्कर असिस्टेड सिलेक्शन के लिए करना है। आम तौर पर, उपयोग किए जाने वाले मार्कर वांछित जीन के करीब (5 पुनर्संयोजन इकाई या cM से कम) होने चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि चयनित व्यक्तियों का केवल एक छोटा सा हिस्सा ही रिकॉम्बिनेंट्स (recombinants) होगा। आम तौर पर, समजात पुनर्संयोजन के कारण त्रुटि की संभावना को कम करने के लिए केवल एक मार्कर नहीं बल्कि दो मार्कर का उपयोग किया जाता है। उदाहरण के लिए, यदि लगभग 20cM के अंतराल के साथ एक ही समय में दो फ़्लैंकिंग मार्करों (flanking markers) का उपयोग किया जाता है, तो लक्ष्य जीन की पुनर्प्राप्ति की उच्च संभावना (99%) होती है।

QTL मैपिंग तकनीक (QTL mapping techniques)

पौधों में QTL मैपिंग आमतौर पर द्वि-पैतृक क्रॉस आबादी (bi-parental cross populations) का उपयोग करके प्राप्त की जाती है; वांछित गुण के लिए एक विपरीत फेनोटाइप वाले दो माता-पिता के बीच एक क्रॉस विकसित किया जाता है। आमतौर पर उपयोग की जाने वाली आबादी पुनः संयोजक अंतःप्रजनित लाइनें (Recombinant inbred lines - RILs), द्विगुणित अगुणित (Doubled haploids - DH), बैक क्रॉस और F2 हैं। पहले से मैप किए गए फेनोटाइप और मार्करों के बीच लिंकेज का परीक्षण QTL की स्थिति निर्धारित करने के लिए इन आबादियों में किया जाता है। ऐसी तकनीकें लिंकेज पर आधारित होती हैं और इसलिए इन्हें "लिंकेज मैपिंग (linkage mapping)" कहा जाता है।

एकल चरण MAS और QTL मैपिंग (Single step MAS and QTL mapping)

दो-चरणीय QTL मैपिंग और MAS के विपरीत, विशिष्ट पौधों की आबादी के प्रजनन के लिए एक-चरणीय विधि विकसित की गई है। इस तरह के दृष्टिकोण में, पहले कुछ प्रजनन चक्रों (breeding cycles) में, वांछित गुण से जुड़े मार्करों की पहचान QTL मैपिंग द्वारा की जाती है और बाद में उसी जानकारी का उपयोग उसी आबादी में किया जाता है। इस दृष्टिकोण में, कई माता-पिता (तीन-तरफ़ा या चार-तरफ़ा क्रॉस में) को पार करके बनाए गए परिवारों से वंशावली संरचनाएं (pedigree structures) बनाई जाती हैं। आणविक मार्करों का उपयोग करके फेनोटाइपिंग और जीनोटाइपिंग दोनों किए जाते हैं जो ब्याज के QTL के संभावित स्थान को मैप करते हैं। यह मार्करों और उनके अनुकूल एलील्स की पहचान करेगा। एक बार जब इन अनुकूल मार्कर एलील्स की पहचान हो जाती है, तो ऐसे एलील्स की आवृत्ति बढ़ जाएगी और मार्कर असिस्टेड सिलेक्शन के प्रति प्रतिक्रिया का अनुमान लगाया जाता है। वांछनीय प्रभाव वाले मार्कर एलील(s) का उपयोग अगले चयन चक्र या अन्य प्रयोगों में किया जाएगा।

उच्च-थ्रूपुट जीनोटाइपिंग तकनीकें (High-throughput genotyping techniques)

हाल ही में उच्च-थ्रूपुट जीनोटाइपिंग तकनीकें विकसित की गई हैं जो कई जीनोटाइप की मार्कर एडेड स्क्रीनिंग की अनुमति देती हैं। यह प्रजनकों (breeders) को पारंपरिक प्रजनन से मार्कर एडेड सिलेक्शन में स्थानांतरित करने में मदद करेगा। इस तरह के स्वचालन (automation) का एक उदाहरण DNA आइसोलेशन रोबोट, केशिका वैद्युतकणसंचलन (capillary electrophoresis) और पिपेटिंग रोबोट (pipetting robots) का उपयोग करना है।

केशिका प्रणाली (capillary system) का एक हालिया उदाहरण एप्लाइड बायोसिस्टम्स 3130 जेनेटिक एनालाइज़र (Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer) है। यह कम से मध्यम थ्रूपुट प्रयोगशालाओं के लिए 4-कैपिलरी वैद्युतकणसंचलन (electrophoresis) उपकरणों की नवीनतम पीढ़ी है।

बैकक्रॉस ब्रीडिंग के लिए MAS का उपयोग (Use of MAS for backcross breeding)

दाता (अनुकूलित नहीं हो सकता है) से प्राप्तकर्ता (आवर्ती - अनुकूलित किस्म) में एक वांछित जीन को स्थानांतरित करने के लिए न्यूनतम पांच या छह-बैकक्रॉस पीढ़ियों (backcross generations) की आवश्यकता होती है। आणविक मार्करों के उपयोग से आवर्ती जीनोटाइप (recurrent genotype) की पुनर्प्राप्ति में तेजी लाई जा सकती है। यदि F1 मार्कर लोकस के लिए हेटेरोजाइगस (heterozygous) है, तो पहले या बाद के बैकक्रॉस पीढ़ियों में मार्कर लोकस पर आवर्ती मूल एलील (s) वाले व्यक्ति भी मार्कर द्वारा टैग किया गया गुणसूत्र (chromosome) ले जाएंगे।

मार्कर असिस्टेड जीन पिरामिडिंग (Marker assisted gene pyramiding)

एक समय में दो या दो से अधिक जीनों का चयन करके रोग और कीड़ों के प्रतिरोध को बढ़ाने के लिए जीन पिरामिडिंग का प्रस्ताव और उपयोग किया गया है। उदाहरण के लिए धान में ऐसे पिरामिड बैक्टीरियल ब्लाइट (bacterial blight) और ब्लास्ट (blast) के खिलाफ विकसित किए गए हैं। इस मामले में मार्करों के उपयोग का लाभ QTL-एलील-लिंक्ड मार्करों (QTL-allele-linked markers) के चयन की अनुमति देता है जिनका समान फेनोटाइपिक प्रभाव होता है।