उत्परिवर्तन और C l B तकनीक को प्रेरित करने के तरीके (Methods of inducing mutations and C l B technique)

म्यूटाजेन (Mutagens)

उत्परिवर्तन (Mutations) कई एजेंटों द्वारा प्रेरित किया जा सकता है; उत्परिवर्तन को प्रेरित करने में सक्षम एजेंटों को म्यूटाजेन कहा जाता है। म्यूटाजेन एक प्राकृतिक (natural) या मानव निर्मित एजेंट (human-made agent) (भौतिक या रासायनिक) है जो DNA (DNA) की संरचना (structure) या अनुक्रम (sequence) को बदल सकता है। विभिन्न उत्परिवर्तजन एजेंटों (mutagenic agents) को निम्नलिखित दो व्यापक समूहों (broad groups) में वर्गीकृत किया जा सकता है:

1. भौतिक म्यूटाजेन (Physical mutagens)
2. रासायनिक म्यूटाजेन (Chemical mutagens)

भौतिक म्यूटाजेन

उत्परिवर्तजन गुणों (mutagenic properties) वाले विभिन्न प्रकार के विकिरणों (radiations) को भौतिक म्यूटाजेन कहते हैं। विकिरण विद्युत चुम्बकीय स्पेक्ट्रम (electromagnetic spectrum) का एक हिस्सा हो सकते हैं जिनकी तरंग दैर्ध्य (wavelength) कम और दृश्य प्रकाश (visible light) की तुलना में उच्च ऊर्जा (higher energy) होती है (उदाहरण: uv किरणें, X किरणें, गामा किरणें और ब्रह्मांडीय किरणें - cosmic rays) या रेडियो आइसोटोप (radio isotopes) के क्षय (decay) द्वारा उत्पादित कण विकिरण (particulate radiations) हो सकते हैं।

विकिरण

विकिरण (Radiation) पहला उत्परिवर्तजन एजेंट (mutagenic agent) था जिसे जाना जाता था; जीन पर इसके प्रभावों की सूचना पहली बार 1920 के दशक में दी गई थी। विकिरण की खोज 1890 के दशक में हुई थी: रोंटजेन (Roentgen) ने 1895 में एक्स-रे (X-rays) की खोज की, बेकरेल (Becquerel) ने 1896 में रेडियोधर्मिता (radioactivity) की खोज की, और मैरी और पियरे क्यूरी (Marie and Pierre Curie) ने 1898 में रेडियोधर्मी तत्वों (radioactive elements) की खोज की। इन तीन खोजों और अन्य ने परमाणु भौतिकी (atomic physics) के जन्म और विद्युत चुम्बकीय विकिरण (electromagnetic radiation) की हमारी समझ को जन्म दिया।

विकिरणों को उनके पथ में मौजूद परमाणुओं (atoms) पर पड़ने वाले प्रभावों के प्रकार के आधार पर दो वर्गों में बांटा गया है:

1. आयनीकरण (ionizing) और
2. गैर - आयनीकरण विकिरण (non – ionizing radiations)

गैर - आयनीकरण विकिरण (Non – ionizing radiations)

पराबैंगनी किरणें (Ultraviolet rays) उत्परिवर्तजन गुणों वाला एकमात्र गैर-आयनीकरण विकिरण (non ionizing radiation) है। तरंग दैर्ध्य (wave length) 100 - 3900 Ao तक होती है और वे विशेष रूप से DNA में मौजूद प्यूरीन (purines) और पाइरीमिडिन (pyrimidines) द्वारा अवशोषित (absorbed) होते हैं। DNA के साथ-साथ पाइरीमिडीन, विशेष रूप से थाइमिन (thymine) द्वारा यूवी किरणों (UV rays) का अधिकतम अवशोषण 254 एनएम (nm) की तरंग दैर्ध्य पर होता है, जो यूवी (UV) की सबसे अधिक उत्परिवर्तजन तरंग दैर्ध्य (mutagenic wavelength) भी है।

यूवी (uv) की उत्परिवर्तजन क्रिया (mutagenic action) DNA पर इसके प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष (direct and indirect) दोनों प्रभावों का परिणाम है। DNA पर यूवी का प्रत्यक्ष प्रभाव (direct effect) दो प्रकार का होता है: (1) पाइरीमिडीन डिमर्स (pyrimidine dimmers) और पाइरीमिडीन हाइड्रेट्स (pyrimidine hydrates) का निर्माण।

आयनीकरण विकिरण (Ionizing radiations)

आयनीकरण विकिरणों को इसलिए कहा जाता है क्योंकि वे अपने पथ में मौजूद परमाणुओं में आयनीकरण (ionization) का कारण बनते हैं। आयनीकरण विकिरण दो प्रकार के होते हैं: (1) कण (particulate) और (2) गैर-कण विकिरण (non particulate radiations)। कण विकिरणों में रेडियोधर्मी क्षय (radioactive decay) के कारण उत्पन्न होने वाले उच्च ऊर्जा परमाणु कण (high energy atomin particles) होते हैं। गैर-कण आयनीकरण विकिरणों (non particulate ionizing radiations) को एक्स किरणों (X rays) और गामा किरणों (gamma rays) द्वारा दर्शाया जाता है जो फोटॉन (photons) से बने उच्च ऊर्जा विकिरण (high energy radiations) हैं।

विकिरणों के आनुवंशिक प्रभाव (genetic effects) (1) प्रत्यक्ष (direct) या (2) अप्रत्यक्ष (indirect) हो सकते हैं। विकिरणों का प्रत्यक्ष प्रभाव सीधे DNA अणु (DNA molecule) में आयनीकरण (ionizations) के कारण उत्पन्न होता है, जबकि उनका अप्रत्यक्ष प्रभाव (indirect effect) DNA के अलावा अन्य अणुओं (molecules) में आयनीकरण के माध्यम से उत्पन्न होता है और माना जाता है कि यह मुक्त मूलक निर्माण (free radical formation) द्वारा मध्यस्थ (mediated) होता है।

विकिरण के स्रोत (Sources of radiation)

विकिरण के प्राकृतिक स्रोत (Natural sources of radiation) तथाकथित पृष्ठभूमि विकिरण (background radiation) उत्पन्न करते हैं। इनमें सूर्य और बाहरी अंतरिक्ष (outer space) से ब्रह्मांडीय किरणें (cosmic rays), मिट्टी और स्थलीय उत्पादों (terrestrial products) (लकड़ी, पत्थर) और वायुमंडल (atmosphere - रेडॉन) में रेडियोधर्मी तत्व शामिल हैं। पृष्ठभूमि विकिरण के कारण किसी का जोखिम (exposure) भौगोलिक स्थिति (geographic location) के साथ बदलता रहता है।

इसके अलावा, मनुष्यों ने विकिरण के कृत्रिम स्रोत (artificial sources) बनाए हैं जो हमारे विकिरण जोखिम (radiation exposure) में योगदान करते हैं। इनमें चिकित्सा परीक्षण (medical testing) (नैदानिक ​​एक्स-रे - diagnostic X-rays और अन्य प्रक्रियाएं), परमाणु परीक्षण (nuclear testing) और बिजली संयंत्र (power plants), और विभिन्न अन्य उत्पाद (टीवी, धुआं डिटेक्टर, हवाई अड्डे के एक्स-रे) शामिल हैं।

रासायनिक म्यूटाजेन

किसी रसायन (chemical) की उत्परिवर्तजन क्रिया की पहली रिपोर्ट 1942 में चार्लोट औएरबैक (Charlotte Auerbach) द्वारा दी गई थी, जिन्होंने दिखाया था कि नाइट्रोजन मस्टर्ड (nitrogen mustard) (प्रथम और द्वितीय विश्व युद्ध में इस्तेमाल होने वाली जहरीली सरसों गैस का घटक) कोशिकाओं में उत्परिवर्तन का कारण बन सकता है। उस समय से, कई अन्य उत्परिवर्तजन रसायनों (mutagenic chemicals) की पहचान की गई है और एक विशाल उद्योग और सरकारी नौकरशाही (government bureaucracy) है जो उन्हें खाद्य योजक (food additives), औद्योगिक कचरे (industrial wastes) आदि में खोजने के लिए समर्पित है। रासायनिक म्यूटाजेन को उनके क्रिया के तरीकों से अलग करना संभव है; इनमें से कुछ उन तंत्रों द्वारा उत्परिवर्तन का कारण बनते हैं जो अनायास (spontaneously) उत्पन्न होते हैं जबकि अन्य उनके प्रभावों में विकिरण की तरह अधिक होते हैं।

1. बेस एनालॉग्स (Base analogs)

ये रसायन संरचनात्मक रूप से प्यूरीन और पाइरीमिडीन के समान होते हैं और DNA प्रतिकृति (DNA replication) के दौरान सामान्य ठिकानों (normal bases) के स्थान पर DNA में शामिल किए जा सकते हैं:

• ब्रोमोरासिल (bromouracil - BU) - कृत्रिम रूप से (artificially) बनाया गया यौगिक अनुसंधान (research) में बड़े पैमाने पर उपयोग किया जाता है। थाइमिन के समान है क्योंकि इसमें मिथाइल समूह (methyl group) के बजाय 5 स्थिति (5 position) में Br है और उसी स्थिति में -CH3 के रूप में इसके बेस पेयरिंग व्यवहार (base pairing behavior) पर समान प्रभाव पड़ता है और इसलिए 5 BU थाइमिन की तरह व्यवहार करता है और आमतौर पर एडेनिन (adenine) के साथ जोड़े (pairs) बनाता है।
• अमीनोप्यूरिन (aminopurine) - एडेनिन एनालॉग (adenine analog) जो T या (कम अच्छी तरह से) C के साथ जोड़ी बना सकता है; A:T से G:C या G:C से A:T संक्रमण (transitions) का कारण बनता है। बेस एनालॉग सहज टॉटोमेराइजेशन (spontaneous tautomerization) घटनाओं की तरह ही संक्रमण का कारण बनते हैं।

2. रसायन जो आधारों की संरचना और युग्मन गुणों को बदलते हैं (Chemicals which alter structure and pairing properties of bases)

ऐसे कई म्यूटाजेन हैं; कुछ प्रसिद्ध उदाहरण (well-known examples) हैं:

• नाइट्रस एसिड (nitrous acid) - खाद्य पदार्थों में नाइट्राइट (nitrites - परिरक्षक) के पाचन (digestion) से बनता है। यह C से U, meC से T, और A से हाइपोक्सैन्थिन डेमिनेशन (hypoxanthine deaminations) का कारण बनता है। DNA में हाइपोक्सैन्थिन C के साथ जोड़े बनाता है और संक्रमण का कारण बनता है। नाइट्रस एसिड द्वारा डेमिनेशन (Deamination), सहज डेमिनेशन (spontaneous deamination) की तरह, संक्रमण का कारण बनता है।
• नाइट्रोसोगुआनिडाइन (nitrosoguanidine), मिथाइल मेथेनसल्फोनेट (methyl methanesulfonate), एथिल मेथेनसल्फोनेट (ethyl methanesulfonate) - रासायनिक म्यूटाजेन जो ठिकानों (bases) के साथ प्रतिक्रिया करते हैं और मिथाइल (methyl) या एथिल समूह (ethyl groups) जोड़ते हैं। प्रभावित परमाणु (affected atom) के आधार पर, बेसीय आधार (alkylated base) एक आधारहीन साइट (baseless site) प्राप्त करने के लिए नीचा (degrade) हो सकता है, जो उत्परिवर्तजन (mutagenic) और पुनर्संयोजन (recombinogenic) है, या DNA प्रतिकृति पर उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप गलत जोड़ी (mispair) हो सकता है।

3. इंटरकलेटिंग एजेंट (Intercalating agents)

एक्रिडीन ऑरेंज (Acridine orange), प्रोफ्लाविन (proflavin), एथिडियम ब्रोमाइड (ethidium bromide) (प्रयोगशालाओं में रंजक - dyes और म्यूटाजेन - mutagens के रूप में उपयोग किया जाता है)। सभी फ्लैट (flat), मल्टीपल रिंग अणु (multiple ring molecules) होते हैं जो DNA के ठिकानों के साथ अंतःक्रिया करते हैं और उनके बीच सम्मिलित (insert) होते हैं। यह सम्मिलन (insertion) DNA डुप्लेक्स (DNA duplex) के "खींचने" ("stretching") का कारण बनता है और DNA पोलीमरेज़ (DNA polymerase) को इंटरकैलेटेड अणु (intercalated molecule) के विपरीत एक अतिरिक्त आधार (extra base) सम्मिलित करने के लिए "मूर्ख" ("fooled") बनाया जाता है। परिणाम यह है कि इंटरकलेटिंग एजेंट फ्रैमेशिफ्ट (frameshifts) का कारण बनते हैं।

4. DNA संरचना को बदलने वाले एजेंट (Agents altering DNA structure)

इसका उपयोग "कैच-ऑल" ("catch-all") श्रेणी के रूप में किया जाता है जिसमें विभिन्न प्रकार के एजेंट (agents) शामिल होते हैं। ये हो सकते हैं:

• --बड़े अणु (large molecules) जो DNA में ठिकानों से बंधते हैं और उन्हें नॉनकोडिंग (noncoding) का कारण बनते हैं -- हम इन्हें "भारी" घावों ("bulky" lesions) (जैसे। NAAAF) के रूप में संदर्भित करते हैं।
• --इंट्रा- और इंटर-स्ट्रैंड क्रॉसलिंग (intra- and inter-strand crosslinks) पैदा करने वाले एजेंट (जैसे सोरालेन्स - psoralens - कुछ सब्जियों में पाए जाते हैं और त्वचा की कुछ स्थितियों के उपचार में उपयोग किए जाते हैं)।
• --DNA स्ट्रैंड टूटने (DNA strand breaks) वाले रसायन (जैसे पेरोक्साइड - peroxides)।

इन एजेंटों में जो समानता है वह यह है कि वे शायद सीधे (directly) नहीं बल्कि उत्परिवर्तजन मरम्मत प्रक्रियाओं (mutagenic repair processes) के प्रेरण (induction) द्वारा उत्परिवर्तन का कारण बनते हैं।

उत्परिवर्तन का पता लगाना (Detection of mutation)

जीन स्तर (gene level) पर उत्परिवर्तन घटना (mutational event) की घटना का पता संबंधित जीव (organism) के एक या अधिक लक्षणों के फेनोटाइपिक अभिव्यक्ति (phenotypic expression) में होने वाले बदलाव (altercation) से लगाया जाता है। इसलिए उत्परिवर्तन का पता लगाने की दक्षता (efficiency) काफी हद तक बहुत बड़ी आबादी (large populations) में उत्परिवर्ती फेनोटाइप (mutant phenotypes) के आसान और तीव्र स्कोरिंग (rapid scoring) के लिए तकनीकों की उपलब्धता (availability) पर निर्भर करेगी। कुछ जीवों में कुछ प्रकार के उत्परिवर्तन का स्कोरिंग (Scoring) अपेक्षाकृत आसान है। उदाहरण के लिए, बैक्टीरिया (bacteria) में एंटीबायोटिक प्रतिरोध (antibiotic resistance) के लिए उत्परिवर्तन संबंधित एंटीबायोटिक की घातक एकाग्रता (lethal concentration) (चयनात्मक माध्यम - selective medium) वाले माध्यम (medium) पर जीवाणु कोशिकाओं (bacterial cells) को चढ़ाना (plating) करके आसानी से पता लगाया जाता है; ऐसे माध्यम पर विकसित होने वाली कॉलोनियां (colonies) एंटीबायोटिक (antibiotic) के प्रतिरोधी कोशिकाओं (resistant cells) द्वारा निर्मित की जाएंगी। एंटीबायोटिक की कमी वाले माध्यम को गैर चयनात्मक माध्यम (non selective medium) कहा जाता है।

यूकेरियोट्स (eukaryotes) में रूपात्मक उत्परिवर्तन (morphological mutations) का पता लगाने के लिए उत्परिवर्ती फेनोटाइप (mutant phenotype) के लिए आबादी के प्रत्येक व्यक्ति (individual) की जांच (examination) की आवश्यकता होती है; यह न केवल समय की आवश्यकता वाला कठिन (tedious) काम है, बल्कि डेटा में त्रुटियों (errors) का भी एक स्रोत है। इसलिए, कुछ यूकेरियोट्स में उत्परिवर्तन (mutation) का पता लगाने के लिए विस्तृत प्रक्रियाएं (elaborate procedures) विकसित की गई हैं। उदा; ड्रोसोफिला (Drosophila), मक्का (maize) आदि। ये प्रक्रियाएं उपचारित या विकिरणित व्यक्तियों (treated or irradiated individuals) से गुणसूत्रों (chromosomes) की पहचान (identification) की सुविधा के लिए विशिष्ट मार्करों (specific markers) को नियोजित करती हैं। स्पष्ट रूप से ये तकनीकें केवल जनन उत्परिवर्तन (germinal mutations) का पता लगाती हैं। ड्रोसोफिला में, एक्स क्रोमोसोम (X chromosomes) और ऑटोसॉम्स (autosomes) में घातक (lethal) और दृश्य उत्परिवर्तन (visible mutations) का पता लगाने के लिए कई विशिष्ट आनुवंशिक स्टॉक (specific genetic stocks) बनाए गए हैं; एक्स गुणसूत्र (X chromosome) में उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले दो आनुवंशिक स्टॉक हैं (1) ClB और (2) संलग्न X स्टॉक (Attached X stocks)।

ClB तकनीक (CIB Technique)

इस पद्धति (method) का आविष्कार मुलर (Muller) द्वारा किया गया था और इसका उपयोग एक्स किरणों की उत्परिवर्तजन क्रिया के स्पष्ट प्रदर्शन (unequivocal demonstration) के लिए किया गया था। इस पद्धति में, एक सामान्य एक्स-क्रोमोसोम (normal X-chromosome) और 3 अतिरिक्त जीन (extra genes) वाले एक अन्य एक्स-क्रोमोसोम (ClB) वाली महिलाओं का विश्लेषण (analysis) के लिए उपयोग किया जाता है। 3 अतिरिक्त जीनों में से, एक जीन क्रॉसओवर (crossover - c) को दबा (suppresses) देता है, दूसरा हेटेरोज़ायगस अवस्था (heterozygous condition) में अप्रभावी घातक (recessive lethal - L) होता है, और अंतिम जीन अर्ध-प्रमुख मार्कर (semidominant marker), बार (Bar - B) जीन है।

ClB क्रोमोसोम (CIB chromosome) वाली महिलाओं को ClB स्टॉक ड्रोसोफिला (CIB stock drosophila) कहा जाता है। सामान्य पुरुषों (normal males) को एक निश्चित अवधि के लिए उत्परिवर्तजन स्रोत (mutagenic source) के संपर्क में लाया जाता है और फिर ClB स्टॉक ड्रोसोफिला के साथ संभोग (mated) किया जाता है। ClB गुणसूत्र वाले पुरुष घातक जीन (lethal genes) के प्रभाव के कारण मर जाएंगे, जबकि सामान्य पुरुष (norm ill males) और महिलाएं दोनों सामान्य और ClB के साथ जीवित रहेंगे (will survive)।

ClB क्रोमोसोम वाली और वर्जित फेनोटाइप (barred phenotype) द्वारा पहचानी जाने वाली महिलाओं का चयन (selected) किया जाता है और उन्हें सामान्य पुरुषों के साथ पार (crossed) किया जाता है। इस अगली पीढ़ी (next generation) में 50% पुरुष (जिन्हें ClB जीन प्राप्त हुआ है) मर जाएंगे।

यदि सामान्य एक्स गुणसूत्र (normal X chromosome) में उत्परिवर्तन हुआ है, तो सामान्य पुरुष (ClB जीन के बिना) भी मर जाएगा। यदि कोई उत्परिवर्तन नहीं हुआ है तो अन्य 50% पुरुष जीवित रहेंगे। बड़े नमूनों (large samples) में घातक उत्परिवर्तन (lethal mutations) की आवृत्ति (frequency) को सटीक (accurately) रूप से स्कोर (scored) किया जा सकता है। यह तकनीक सरल (simple), तेज (rapid) है और स्कोरिंग में त्रुटि (error) की बहुत कम संभावना है। हालांकि, यह केवल सेक्स लिंक्ड अप्रभावी घातक (sex linked recessive lethal) के स्कोरिंग के लिए उपयुक्त (suitable) है।

संलग्न एक्स गुणसूत्र तकनीक (The attached X chromosome technique)

यह तकनीक (technique) संलग्न-एक्स महिलाओं (attached – X females - X- XY) पर आधारित है और इसे ड्रोसोफिला में दृश्यमान सेक्स लिंक्ड उत्परिवर्तन (visible sex linked mutations) का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। म्यूटाजेन उपचारित पुरुषों (Mutagen treated males) को संलग्न एक्स महिलाओं (attached X females) के साथ जोड़ा जाता है। इस तरह के क्रॉस (crosses) से उत्पन्न होने वाली X- XX (सुपर महिला - super female) और YY संतानें (progeny) जीवित नहीं रहती हैं; केवल X- XY (महिला) और XY (पुरुष) संतानें प्राप्त (recovered) होती हैं। सभी नर (XY) संतानों को उनके Y गुणसूत्र (Y chromosomes) उनके संलग्न X महिला माता-पिता (attached X female parent) से प्राप्त होते हैं, जबकि उनके X गुणसूत्रों का योगदान उनके म्यूटाजेन उपचारित पुरुष माता-पिता (mutagen treated male parent) द्वारा किया जाता है। यदि म्यूटाजेन उपचारित पुरुष (mutagen treated male) द्वारा उत्पादित किसी भी शुक्राणु (sperm) के एक्स गुणसूत्रों में एक दृश्य उत्परिवर्तन (visible mutation) प्रेरित (induced) किया गया था, तो यह पुरुष संतान (male progeny) में व्यक्त किया जाएगा। इसलिए क्रॉस (cross) से प्राप्त सभी पुरुष संतानों को दृश्यमान उत्परिवर्तन के लिए स्कोर किया जाता है। एक दृश्य उत्परिवर्तन की आवृत्ति को उत्परिवर्तन दिखाने वाले संतानों के पुरुषों (progeny males) की संख्या और संतानों में पुरुषों की कुल संख्या के बीच अनुपात (ratio) के रूप में व्यक्त (expressed) किया जाता है।

पौधों में उत्परिवर्तन का पता लगाना (Detection of mutations in plants)

पौधों की प्रजातियों (plant species) के लिए उत्परिवर्तन का पता लगाने की तकनीकें अपेक्षाकृत खराब विकसित (relatively poorly developed) हैं। इस उद्देश्य (purpose) के लिए आम तौर पर निम्नलिखित दो दृष्टिकोण (approaches) अपनाए जाते हैं। (1) कुछ प्रजातियों (species) में, उदा; मक्का, कई अप्रभावी जीनों (recessive genes) के साथ-साथ इन जीनों के प्रमुख एलीलों (dominant alleles) के लिए समरूप उपभेद (strains homozygous) उपलब्ध हैं। ऐसे मामलों में कई प्रमुख जीनों (dominant genes) के लिए समरूप (homozygous) स्ट्रेन (strain) के बीज (seeds) या पौधों (plants) को एक म्यूटाजेन (mutagen) के साथ इलाज (treated) किया जाता है। पौधों (M1 पीढ़ी - M1 generation) को संबंधित जीनों (concerned genes) द्वारा शासित लक्षणों के अप्रभावी रूपों (recessive forms) वाले एक स्ट्रेन के साथ पार किया जाता है, गिना जाता है और एक जीन के लिए उत्परिवर्तन की आवृत्ति का अनुमान (estimated) निम्नानुसार किया जाता है:

ऐसे लक्षण के अप्रभावी रूप (recessive form) को दिखाने वाले पौधों को अप्रभावी लक्षणों (recessive traits) वाले परीक्षक माता-पिता (tester parent) से एक अप्रभावी एलील (recessive allele) प्राप्त होगा, जबकि दूसरा अप्रभावी एलील म्यूटाजेन उपचारित माता-पिता (mutagen treated parent) में उत्परिवर्तन के कारण उत्पन्न हुआ होगा।