व्याख्यान 13 - 14 (Lecture 13 - 14)

प्रोटीन का विन्यास (Conformation of proteins)

प्रोटीन के विन्यास (Conformation of a protein) का तात्पर्य इसकी मूल स्थिति (native state) में त्रि-आयामी संरचना (three-dimensional structure) से है। एक प्रोटीन जितने बड़े अणु के लिए कई अलग-अलग संभावित विन्यास (conformations) हैं। एक प्रोटीन अपना कार्य तभी कर सकता है जब वह अपनी मूल स्थिति (native condition) में हो। त्रि-आयामी संरचनाओं की जटिलता के कारण, प्रोटीन की संरचना पर इसके संगठन के विभिन्न स्तरों पर चर्चा की जाती है।

प्रोटीन में संरचनात्मक संगठन (structural organization) के चार स्तरों को प्रतिष्ठित किया जा सकता है:

1. प्राथमिक (Primary)
2. माध्यमिक (Secondary)
3. तृतीयक (Tertiary)
4. चतुर्धातुक (Quaternary)

प्राथमिक संरचना (Primary structure)

• प्रोटीन की प्राथमिक संरचना (Primary structure) अमीनो एसिड की संख्या और उस क्रम को संदर्भित करती है जिसमें वे सहसंयोजक (covalently) रूप से एक साथ जुड़े होते हैं।
• यह एक पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला (polypeptide chain) में डाइसल्फ़ाइड पुलों (disulfide bridges) के स्थान, यदि कोई हो, को भी संदर्भित करता है।
• पेप्टाइड बॉन्ड (peptide bond) प्रकृति में सहसंयोजक (covalent) है, शांत स्थिर (quiet stable) है और इसे प्रोटीन की रीढ़ (backbone) के रूप में संदर्भित किया जाता है।
• उन्हें रासायनिक या एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस (enzymatic hydrolysis) द्वारा बाधित (disrupted) किया जा सकता है लेकिन वे नमक एकाग्रता (salt concentration), pH में परिवर्तन या विलायक (solvent) से सीधे प्रभावित नहीं होते हैं।
• फ्रेडरिक सेंगर (Frederick Sanger) ने 1953 में पहली बार इंसुलिन (insulin) के पूर्ण अमीनो एसिड अनुक्रम (amino acid sequence) का निर्धारण किया था।

प्रोटीन की प्राथमिक संरचना निर्धारित करने में शामिल महत्वपूर्ण चरण हैं:

• प्रोटीन में पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाओं या सबयूनिट्स (subunits) की संख्या (रासायनिक रूप से भिन्न) का निर्धारण।
• पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाओं का पृथक्करण (Separation) यदि एक प्रोटीन में एक से अधिक मौजूद हैं।
• सबयूनिट्स के अमीनो एसिड अनुक्रम (amino acid sequence) का निर्धारण।
• सबयूनिट्स के बीच और भीतर डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड (disulfide bonds) की स्थिति का स्पष्टीकरण (Elucidation), यदि कोई हो।

1. पॉलीपेप्टाइड्स या सबयूनिट्स की संख्या का निर्धारण (Determination of number of polypeptides or subunits)

C-टर्मिनल (C-terminal) या N-टर्मिनल (N-terminal) अमीनो एसिड की संख्या का निर्धारण प्रोटीन में पॉलीपेप्टाइड्स की संख्या को इंगित करेगा।

• फ्लूरो डाइनाइट्रो बेंजीन (Fluoro dinitro benzene - FDNB), जिसे सेंगर के अभिकर्मक (Sanger's reagent) के रूप में जाना जाता है, का उपयोग N-टर्मिनल अमीनो एसिड की पहचान करने के लिए किया गया था।
• इस अभिकर्मक को डैनसिल क्लोराइड (dansyl chloride) और एडमैन अभिकर्मक (Edman's reagent) (फेनिल आइसोथियोसाइनेट - phenyl isothiocyanate, PITC) द्वारा बदल दिया गया था।
• एडमैन के अभिकर्मक का उपयोग पॉलीपेप्टाइड को एडमैन क्षरण (Edman degradation) के दोहराए गए चक्रों के अधीन करके N-टर्मिनल से पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के अमीनो एसिड अनुक्रम को निर्धारित करने के लिए भी किया जाता है।
• हर चक्र के बाद, नए मुक्त फेनिलथियोहाइडेंटोइन (phenylthiohydantoin - PTH) अमीनो एसिड की पहचान की गई थी।
• एडमैन की गिरावट विधि (Edman's degradation method) को अपनाकर अनुक्रमक (sequencer) का उपयोग करके 30-40 अमीनो एसिड वाले पेप्टाइड्स के अनुक्रम को निर्धारित किया जा सकता है।

• C-टर्मिनल अमीनो एसिड को N-टर्मिनल एसिड के लिए उपयोग की जाने वाली विधियों के समान विधियों द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।
• हाइड्राज़ीन (Hydrazine) का उपयोग C-टर्मिनल अमीनो एसिड का पता लगाने के लिए किया जाता है।
• यह C-टर्मिनल अमीनो एसिड को छोड़कर प्रत्येक पेप्टाइड बॉन्ड के कार्बोनिल समूह (carbonyl group) के साथ प्रतिक्रिया करता है।
• बंधन टूट जाता है (cleaved) और प्रत्येक अमीनो एसिड व्युत्पन्न (derivative) हाइड्राज़ाइड व्युत्पन्न (hydrazinolysis) के रूप में जारी किया जाता है।
• चूंकि C-टर्मिनल अमीनो एसिड का कार्बोक्सिल समूह पेप्टाइड बॉन्ड में शामिल नहीं होता है, यह मिश्रण में एकमात्र असंशोधित (unmodified) अमीनो एसिड के रूप में रहता है।
• क्रोमैटोग्राफिक पृथक्करण (chromatographic separation) और मानकों (standards) के साथ तुलना के बाद, C-टर्मिनल अमीनो एसिड की पहचान की जा सकती है।
• कार्बोक्सीपेप्टिडेस (Carboxypeptidases) का उपयोग C-टर्मिनल अमीनो एसिड के एंजाइमिक निर्धारण (enzymic determination) के लिए किया जाता है।

पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाओं का पृथक्करण और शुद्धिकरण (Separation and purification of polypeptide chains)

• C-टर्मिनल और/या N-टर्मिनल अमीनो एसिड का निर्धारण प्रोटीन में एक या अधिक पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाओं की उपस्थिति को प्रकट करता है।
• यदि प्रोटीन में एक से अधिक पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला होती है, तो पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला का पृथक्करण आवश्यक है।
• यदि पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाएं डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड द्वारा जुड़ी हुई हैं, तो वे अलग-अलग पेप्टाइड श्रृंखलाओं को अलग करने के लिए क्लीव (cleaved) की जाती हैं।
• पॉलीपेप्टाइड का उपचार 2-मर्कैप्टोएथेनॉल (2-mercaptoethanol - HS-CH2-CH2OH) से किया जाता है ताकि रिडक्टिव क्लीवेज (reductive cleavage) हो सके और पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाएं अलग हो जाएं।
• परिणामस्वरूप मुक्त-SH समूहों (free-SH groups) को आमतौर पर आयोडोएसेटिक एसिड (iodoacetic acid) के उपचार द्वारा अल्काइलेटेड (alkylated) किया जाता है।
• मर्कैप्टोएथेनॉल का उपयोग करके डाइसल्फ़ाइड लिंक को तोड़ने के बाद, सबयूनिट्स को यूरिया या गुइनिडिनम आयन (guinidinum ion) या सोडियम डोडेसिल सल्फेट (sodium dodecyl sulphate - SDS) जैसे डिटर्जेंट (detergents) का उपयोग करके अलग (dissociated) किया जाता है।
• अलग किए गए सबयूनिट्स (dissociated subunits) को फिर आयन एक्सचेंज (ion exchange) या जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफिक विधि (gel filtration chromatographic method) का उपयोग करके अलग किया जाता है।

पॉलीपेप्टाइड्स का अमीनो एसिड अनुक्रमण (Amino acid sequencing of polypeptides)

• 30-40 अमीनो एसिड वाले पॉलीपेप्टाइड्स में अमीनो एसिड अनुक्रम एडमैन प्रतिक्रिया (Edman reaction) द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।
• 40 से अधिक अमीनो एसिड युक्त पॉलीपेप्टाइड्स के लिए, पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाओं को छोटे पेप्टाइड्स में तोड़ने के लिए एंजाइमेटिक (enzymatic) और रासायनिक (chemical) दोनों तरीकों का उपयोग किया जाता है।
• एंजाइम ट्रिप्सिन (trypsin) लाइसिन या आर्जिनिन के क्षारीय अमीनो एसिड अवशेषों (basic amino acid residues) के कार्बोक्सिल किनारे पर पेप्टाइड बॉन्ड को हाइड्रोलाइज (hydrolyses) करता है।
• रासायनिक अभिकर्मक, सायनोजेन ब्रोमाइड (cyanogens bromide) मेथियोनीन अवशेषों (methionine residues) के कार्बोक्सिल पक्ष (carboxyl side) पर पेप्टाइड बॉन्ड को तोड़ता है।
• हाइड्रोलाइज्ड पेप्टाइड्स को अलग किया जाता है और अमीनो एसिड अनुक्रम (amino acid sequence) एडमैन प्रतिक्रिया (Edman reaction) द्वारा निर्धारित किया जाता है।
• मूल पॉलीपेप्टाइड का हाइड्रोलिसिस (hydrolysis) दो अलग-अलग विधियों द्वारा अलग-अलग ओवरलैपिंग क्षेत्रों (overlapping regions) को देता है, जिससे अनुक्रम प्राप्त (derived) होता है।

माध्यमिक संरचना (Secondary structure)

• माध्यमिक संरचना (Secondary structure) रैखिक अनुक्रम (linear sequence) में एक-दूसरे के करीब होने वाले अमीनो एसिड के स्टेरिक संबंधों (steric relationship) को संदर्भित करती है।
• एक रैखिक पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला की तह एक विशिष्ट कुंडलित संरचना (specific coiled structure) बनाने के लिए होती है।
• इस तरह की कोइलिंग (coiling) या फोल्डिंग (folding) को हाइड्रोजन बॉन्ड द्वारा बनाए रखा जाता है और हाइड्रोजन बॉन्ड ही माध्यमिक संरचना के लिए जिम्मेदार एकमात्र बॉन्ड है।
• लिनस पॉलिंग (Linus Pauling) और रॉबर्ट कोरी (Robert Corey) द्वारा कई पॉलीपेप्टाइड्स के एक्स-रे अध्ययनों (X-ray studies) से पता चला है कि पेप्टाइड समूह (peptide group) में एक कठोर, समतलीय संरचना (rigid, planar structure) होती है जो अनुनाद इंटरैक्शन (resonance interactions) का परिणाम है जो पेप्टाइड बॉन्ड को 40% डबल बॉन्ड चरित्र (double bond character) देता है।
• पेप्टाइड समूह ज्यादातर ट्रांसकन्फर्मेशन (transconformation) ग्रहण करते हैं जिसमें क्रमिक C2 परमाणु पेप्टाइड बॉन्ड के विपरीत किनारों पर होते हैं जो उन्हें जोड़ते हैं।
• सिस विन्यास (cis configuration) स्टेरिक हस्तक्षेप (steric interference) बनाता है।
• यदि एक पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला को उसके C परमाणुओं में से प्रत्येक को समान मात्रा में घुमाया (twisted) जाता है, तो यह एक पेचदार विन्यास (helical conformation) ग्रहण करता है।

हेलिक्स संरचना (Helix structure)

• α-हेलिक्स (α-helix) पॉलीपेप्टाइड्स की सबसे स्थिर व्यवस्था (stable arrangement) है।
• प्रोटीन की हेलिक्स संरचना (helix structure) इंट्रामोल्युलर हाइड्रोजन बॉन्डिंग (intramolecular hydrogen bonding) द्वारा स्थिर (stabilized) होती है।
• इस संरचना में, 3 अमीनो एसिड इकाइयों के बाद एक पेप्टाइड बॉन्ड के C=O समूह और दूसरे के N-H समूह के बीच हाइड्रोजन बॉन्ड (hydrogen bonds) बनते हैं।
• L-अमीनो एसिड द्वारा गठित पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला दाहिने हाथ का हेलिक्स (right-handed helix) बनाती है, जबकि D-अमीनो एसिड से बनी पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाएं बाएं हाथ का हेलिक्स (left-handed helix) बनाती हैं।
• α-पेचदार विन्यास (α-helical conformation) में, सभी साइड चेन (side chains) हेलिक्स के बाहर स्थित होते हैं जबकि पेप्टाइड बॉन्ड के C, N, O और H एक ही तल (plane) में स्थित होते हैं।
• कुछ अमीनो एसिड α-हेलिक्स (α-helix) को बाधित (disrupt) करते हैं। इनमें प्रोलाइन (proline - N परमाणु कठोर अंगूठी का हिस्सा है और N-C बॉन्ड का कोई घूर्णन नहीं हो सकता है) और आवेशित या थोक R समूहों (bulk R groups) के साथ अमीनो एसिड शामिल हैं जो इलेक्ट्रोस्टैटिक या भौतिक रूप से हेलिक्स गठन में हस्तक्षेप करते हैं।

β-प्लीटेड शीट संरचना (The β-pleated sheet structure)

• पॉलिंग और कोरी ने पॉलीपेप्टाइड के लिए एक दूसरी क्रमबद्ध संरचना, β-प्लीटेड शीट (β-pleated sheet) का भी प्रस्ताव दिया।
• यह संरचना एक शीट जैसी व्यवस्था बनाने के लिए पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाओं के बीच इंटरमॉलिक्युलर हाइड्रोजन बॉन्डिंग (intermolecular hydrogen bonding) का परिणाम है।
• प्रोटीन श्रृंखलाएं दो तरह से प्लीटेड शीट संरचना बना सकती हैं।
• एक दिशा में चलने वाली जंजीरों (chains) के साथ है यानी पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाओं के -COOH या NH₂ सिरे सभी शीर्ष पर या सभी शीट के निचले भाग में स्थित हैं। इसे समानांतर प्लीटेड-शीट संरचना (parallel pleated-sheet structure) कहा जाता है।
• एक अन्य प्रकार में, जिसे एंटीपैरेलल β-प्लीटेड शीट संरचना (antiparallel β-pleated sheet structure) के रूप में जाना जाता है, पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाएं इस तरह से वैकल्पिक होती हैं कि एक पॉलीपेप्टाइड का -COOH सिरा दूसरे के -NH₂ सिरे के बगल में होता है, यानी पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाएं विपरीत दिशाओं (opposite directions) में चलती हैं।

रैंडम कॉइल (The random coil)

• प्रोटीन के क्षेत्र जो हेलिकॉप्टर (helices) या प्लीटेड शीट (pleated sheets) के रूप में पहचाने जाने योग्य नहीं हैं, उन्हें रैंडम कॉइल विन्यास (random coil conformation) में मौजूद कहा जाता है।
• प्रोटीन का काफी हिस्सा इस विन्यास (conformation) में मौजूद हो सकता है।
• 'रैंडम' (random) शब्द दुर्भाग्यपूर्ण है जिसका अर्थ अत्यधिक दोहराए जाने वाले क्षेत्रों की तुलना में कम जैविक महत्व है।
• लेकिन जैविक कार्य के संदर्भ में, रैंडम कॉइल के क्षेत्र हेलिक्स और प्लीटेड शीट के समान महत्व के हैं।

तृतीयक संरचना (Tertiary structure)

• तृतीयक संरचना (Tertiary structure) रैखिक अनुक्रम (linear sequence) में बहुत दूर स्थित अमीनो एसिड अवशेषों (amino acid residues) के स्टेरिक संबंधों (steric relationship) को संदर्भित करती है।
• यह पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाओं को विशिष्ट छोरों (specific loops) और मोड़ों (bends) में घुमाने (twisting) की ओर जाता है जो मुख्य रूप से पांच प्रकार के बंधों (bonds) द्वारा बनाए रखा जाता है।

• हाइड्रोजन बॉन्ड (Hydrogen bonds) अमीनो एसिड की साइड चेन (R समूह) के बीच बनते हैं जिसमें हाइड्रोजन डोनर समूह (hydrogen donor group) और एक्सेप्टर समूह (acceptor group) होता है।

• नमक के जुड़ाव (Salt linkages) क्षारीय अमीनो एसिड (basic amino acids) के एमिनो समूहों (amino groups) और R समूह में मौजूद अम्लीय अमीनो एसिड के कार्बोक्सिल समूह के बीच बातचीत (interaction) के कारण होते हैं।

• S-S लिंकेज दो सिस्टीन साइड चेन (cysteine side chains) के सल्फहाइड्रील (-SH) समूह के ऑक्सीकरण (oxidation) द्वारा बनते हैं।

• हाइड्रोफोबिक बॉन्ड (Hydrophobic bonds) गैर-ध्रुवीय (non-polar) साइड चेन के बीच बातचीत के परिणामस्वरूप बनते हैं।

• यह अंतःक्रिया ध्रुवीय असंबद्ध साइड चेन (polar unionized side chains) के बीच होती है।
• विभिन्न सहसंयोजक और गैर-सहसंयोजक इंटरैक्शन (covalent and non-covalent interactions) के कारण पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला (polypeptide chain) का तह (folding) नीचे दिखाया गया है।

• उपरोक्त बंधों में से, डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड (सहसंयोजक बंधन - covalent bond) सबसे मजबूत (strongest) है और विलायक (solvent), pH, तापमान और लवण से प्रभावित नहीं हो सकता है।
• डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड को क्रमशः ऑक्सीकरण/कमी (oxidation/reduction) द्वारा विभाजित और सुधारा जा सकता है।
• एंजाइमों (enzymes) के मामले में तृतीयक संरचना (tertiary structure) विशेष महत्व प्राप्त करती है।

डोमेन (Domain)

• डोमेन (Domains) संरचनात्मक रूप से स्वतंत्र इकाइयाँ (structurally independent units) हैं जिनमें छोटे गोलाकार प्रोटीन (small globular protein) की विशेषताएं हैं।
• डोमेन में अक्सर एक विशिष्ट कार्य (specific function) होता है जैसे छोटे अणु को बांधना।
• एक प्रोटीन का एक लंबा पेप्टाइड स्ट्रैंड (peptide strand) अक्सर कई, कॉम्पैक्ट अर्ध-स्वतंत्र (semiindependent) मुड़े हुए क्षेत्रों या डोमेन में बदल जाता है।
• प्रत्येक डोमेन में एक हाइड्रोफोबिक कोर (hydrophobic core) और ध्रुवीय सतह (polar surface) के साथ एक विशेषता गोलाकार ज्यामिति (spherical geometry) होती है जो पूरे गोलाकार प्रोटीन की तृतीयक संरचना (tertiary structure) की तरह होती है।
• मल्टीडोमेन प्रोटीन (multidomain protein) के डोमेन अक्सर नियमित माध्यमिक संरचना (regular secondary structure) की कमी वाले पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के एक खंड (segment) से आपस में जुड़े होते हैं।
• एक से अधिक सब्सट्रेट (substrate) या एलोस्टेरिक इफ़ेक्टर साइट्स (allosteric effector sites) वाले एंजाइमों में अलग-अलग बाइंडिंग साइट्स (binding sites) अक्सर अलग-अलग डोमेन में स्थित होती हैं।
• बहुक्रियाशील प्रोटीनों (multifunctional proteins) में, विभिन्न डोमेन विभिन्न कार्य करते हैं।

चतुर्धातुक संरचना (Quaternary structure)

• प्रोटीन जिनमें एक से अधिक सबयूनिट (subunit) या पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाएं (polypeptide chains) होती हैं, चतुर्धातुक संरचना (quaternary structure) प्रदर्शित करेंगे।
• चतुर्धातुक संरचना सबयूनिट्स या पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाओं के इंटरपॉलीपेप्टाइड लिंकेज (interpolypeptide linkage) द्वारा गठित कार्यात्मक प्रोटीन कुल (functional protein aggregate - संगठन) को संदर्भित करती है।
• इन सबयूनिट्स को ध्रुवीय (polar) साइड चेन के बीच गैर-सहसंयोजक सतह इंटरैक्शन (noncovalent surface interaction) द्वारा एक साथ रखा जाता है।
• ऊपर की तरह बनने वाले प्रोटीन को ऑलिगोमर्स (oligomers) कहा जाता है और व्यक्तिगत पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाओं को विभिन्न रूप से प्रोटोमर्स (protomers), मोनोमर्स (monomers) या सबयूनिट्स (subunits) कहा जाता है।
• सबसे आम ओलिगोमेरिक प्रोटीन (oligomeric proteins) में दो या चार प्रोटोमर होते हैं और इन्हें क्रमशः डिमर (dimers) या टेट्रामर (tetramers) कहा जाता है।
• मायोग्लोबिन (Myoglobin) की कोई चतुर्धातुक संरचना नहीं है क्योंकि, यह एक एकल पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला (single polypeptide chain) से बना है।
• हीमोग्लोबिन अणु (Hemoglobin molecule), जिसमें चार अलग-अलग पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाएं होती हैं, चतुर्धातुक संरचना (quaternary structure) प्रदर्शित करता है।

चित्र: Schematic of hemoglobin

हीमोग्लोबिन की योजना (A schematic of hemoglobin)। रिबन भाग (ribbon parts) प्रोटीन ग्लोबिन (protein globin) का प्रतिनिधित्व करते हैं; चार हरे भाग हीम समूह (heme groups) हैं।

• चतुर्धातुक संरचना (Quaternary structure) एंजाइमों की गतिविधि को प्रभावित कर सकती है।
• कुछ एंजाइम केवल अपनी चतुर्धातुक स्थिति (quaternary state) में ही सक्रिय होते हैं और जब छोटी इकाइयों में विभाजित हो जाते हैं तो निष्क्रिय (inactive) हो जाते हैं।
• अन्य एंजाइम चतुर्धातुक अवस्था में निष्क्रिय (inactive) होते हैं और केवल तभी सक्रिय (activated) होते हैं जब वे मोनोमेरिक अवस्था (monomeric state) बनाने के लिए अलग हो जाते हैं।

प्रोटीन के भौतिक और रासायनिक गुण (Physical and chemical properties of proteins)

भौतिक (Physical)

• शुद्ध प्रोटीन आम तौर पर बेस्वाद (tasteless) होते हैं, हालांकि प्रोटीन हाइड्रोलाइज़ेट (protein hydrolysates) का प्रमुख स्वाद कड़वा (bitter) होता है।
• शुद्ध प्रोटीन गंधहीन (odourless) होते हैं।
• अणुओं के बड़े आकार के कारण, प्रोटीन कई गुण प्रदर्शित करते हैं जो प्रकृति में कोलाइडल (colloidal) हैं।
• प्रोटीन, अमीनो एसिड की तरह, उभयधर्मी (amphoteric) हैं और इनमें अम्लीय (acidic) और क्षारीय (basic) दोनों समूह होते हैं।
• उनमें विद्युत रूप से आवेशित समूह (electrically charged groups) होते हैं और इसलिए वे एक विद्युत क्षेत्र (electric field) में पलायन (migrate) करते हैं।
• कई प्रोटीन अस्थिर (labile) होते हैं और आसानी से pH, UV विकिरण (UV radiation), गर्मी और कई कार्बनिक सॉल्वैंट्स (organic solvents) में परिवर्तन (alterations) द्वारा संशोधित (modified) हो जाते हैं।
• प्रोटीन का अवशोषण स्पेक्ट्रम (absorption spectrum) टायरोसिन और ट्रिप्टोफैन की उपस्थिति के कारण 280 एनएम पर अधिकतम होता है, जो उस क्षेत्र में सबसे मजबूत क्रोमोफोर्स (strongest chromophores) हैं।
• इसलिए इस तरंग दैर्ध्य (wavelength) पर प्रोटीन का अवशोषण (absorbance) इसके निर्धारण (determination) के लिए अनुकूलित (adapted) है।

प्रोटीन का विकृतीकरण (Denaturation of protein)

• प्रोटीन की माध्यमिक, तृतीयक और चतुर्धातुक संरचना को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार तुलनात्मक रूप से कमजोर बल (weak forces) जैविक गतिविधि (biological activity) के नुकसान के साथ आसानी से बाधित (disrupted) हो जाते हैं।
• मूल संरचना (native structure) के इस व्यवधान (disruption) को विकृतीकरण (denaturation) कहा जाता है।
• शारीरिक रूप से, विकृतीकरण को एक पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के विन्यास (conformation) को उसके प्राथमिक संरचना को प्रभावित किए बिना यादृच्छिक (randomizing) करने के रूप में देखा जाता है।
• प्रोटीन के विकृतीकरण में भौतिक (Physical) और रासायनिक कारक (chemical factors) शामिल हैं:

1. गर्मी (Heat) और यूवी विकिरण (UV radiation) प्रोटीन अणुओं को गतिज ऊर्जा (kinetic energy) की आपूर्ति करते हैं जिससे परमाणु तेजी से कंपन (vibrate rapidly) करते हैं, इस प्रकार अपेक्षाकृत कमजोर हाइड्रोजन बॉन्ड और नमक लिंकेज को बाधित करते हैं। इसके परिणामस्वरूप प्रोटीन का विकृतीकरण होता है जिससे जमाव (coagulation) होता है। एंजाइम आसानी से विकृत (denatured) या जमा हुआ प्रोटीन (coagulated proteins) को पचा लेते हैं।
2. इथाइल अल्कोहल (ethyl alcohol) और एसीटोन (acetone) जैसे कार्बनिक सॉल्वैंट्स (Organic solvents) प्रोटीन के साथ इंटरमॉलिक्युलर हाइड्रोजन बॉन्ड (intermolecular hydrogen bonds) बनाने में सक्षम हैं जो इंट्रामोल्युलर हाइड्रोजन बॉन्डिंग (intramolecular hydrogen bonding) को बाधित करते हैं। इससे प्रोटीन का अवक्षेपण (precipitation) होता है।
3. अम्लीय (Acidic) और क्षारीय अभिकर्मक (basic reagents) pH में परिवर्तन का कारण बनते हैं, जो नमक के जुड़ाव (salt linkages) को बाधित करने वाले प्रोटीन की साइड चेन पर मौजूद आवेशों (charges) को बदल देते हैं।
4. भारी धातु आयनों (heavy metal ions - Hg²⁺, Pb²⁺) के लवण (Salts) एस्पार्टेट (aspartate) और ग्लूटामेट (glutamate) के कार्बोक्सिलेट आयनों (carboxylate anions) के साथ बहुत मजबूत बंधन (strong bonds) बनाते हैं जिससे नमक संबंध (salt linkages) परेशान (disturbing) होते हैं। यह संपत्ति एंटीसेप्टिक्स (antiseptics) के रूप में उपयोग के लिए कुछ भारी धातु लवणों (heavy metal salts) को उपयुक्त बनाती है।

रेन्चुरेशन (Renaturation)

• रेन्चुरेशन (Renaturation) से तात्पर्य प्रोटीन के विकृतीकरण के बाद एक मूल, नियमित त्रि-आयामी (three-dimensional) कार्यात्मक प्रोटीन की प्राप्ति से है।
• जब सक्रिय (active) अग्नाशयी राइबोन्यूक्लिज़ ए (pancreatic ribonuclease A) को 8M यूरिया (urea) या मर्कैप्टोएथेनॉल (mercaptoethanol) के साथ व्यवहार किया जाता है, तो इसे एक निष्क्रिय (inactive), विकृत अणु (denatured molecule) में बदल दिया जाता है।
• जब यूरिया या मर्कैप्टोएथेनॉल हटा दिया जाता है, तो यह अपने मूल (सक्रिय) विन्यास (native (active) conformation) को प्राप्त कर लेता है।

रासायनिक (Chemical)

प्रोटीन की रंग प्रतिक्रियाएं (Colour reactions of proteins)

• प्रोटीन की रंग प्रतिक्रियाएं प्रोटीन और उनके घटक अमीनो एसिड (constituent amino acids) के गुणात्मक पहचान (qualitative detection) और मात्रात्मक अनुमान (quantitative estimation) में महत्वपूर्ण हैं।
• जैविक सामग्री (biological materials) में प्रोटीन का पता लगाने के लिए बायूरेट परीक्षण (Biuret test) का बड़े पैमाने पर परीक्षण के रूप में उपयोग किया जाता है।

• एक यौगिक, जिसमें बायूरेट अभिकर्मक (Biuret reagent) के साथ इलाज किए जाने पर एक से अधिक पेप्टाइड बॉन्ड (peptide bond) होते हैं, एक बैंगनी रंग (violet colour) पैदा करता है। यह दो पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाओं (polypeptide chains) के चार नाइट्रोजन परमाणुओं और एक तांबे परमाणु (copper atom) के बीच समन्वय परिसर (coordination complex) के गठन के कारण है।

• प्रोटीन में केंद्रित नाइट्रिक एसिड (concentrated nitric acid) जोड़ने से गर्म होने पर पीला रंग (yellow colour) उत्पन्न होता है, घोल को क्षारीय (alkaline) बनाने पर रंग नारंगी (orange) हो जाता है। त्वचा पर पीले धब्बे (yellow stains) जो नाइट्रिक एसिड के कारण होते हैं, इस ज़ैंथोप्रोटिक प्रतिक्रिया (xanthoproteic reaction) का परिणाम हैं। यह सुगंधित अमीनो एसिड (aromatic amino acids) के फिनाइल छल्ले (phenyl rings) के नाइट्रेशन (nitration) के कारण होता है।

• ट्रिप्टोफैन की इंडोल रिंग (Indole ring) केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड (concentrated sulphuric acid) की उपस्थिति में हिमनद एसिटिक एसिड (glacial acetic acid) के साथ प्रतिक्रिया करती है और एक बैंगनी रंग का उत्पाद (purple coloured product) बनाती है। ग्लेशियल एसिटिक एसिड (Glacial acetic acid) केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड के साथ प्रतिक्रिया करता है और ग्लाइऑक्सालिक एसिड (glyoxalic acid) बनाता है, जो बदले में सल्फ्यूरिक एसिड की उपस्थिति में ट्रिप्टोफैन की इंडोल रिंग के साथ प्रतिक्रिया करता है जिससे बैंगनी रंग का उत्पाद (purple coloured product) बनता है।