पौधों के रोग प्रबंधन में जैव प्रौद्योगिकी

पौधों के रोग प्रबंधन में जैव प्रौद्योगिकी का अनुप्रयोग - महत्व, ऊतक संवर्धन तकनीकों के माध्यम से रोगजनक मुक्त पौधों का उत्पादन

आधुनिक शब्दों में "जैव प्रौद्योगिकी" ("biotechnology") को ऊतक संवर्धन और आनुवंशिक इंजीनियरिंग जैसी नवीन तकनीकों के माध्यम से जीवित जीवों के हेरफेर, आनुवंशिक संशोधन और गुणन के रूप में परिभाषित किया गया है, जिससे बेहतर या नए जीवों और उत्पादों का उत्पादन होता है जिनका उपयोग विभिन्न तरीकों से किया जा सकता है।

जेनेटिक इंजीनियरिंग वह तकनीक है जिसके द्वारा एक जीव से विशेष जीन को अलग करना, उन्हें दूसरे जीव के जीनोम में सम्मिलित करना और उन्हें सही समय पर व्यक्त करना संभव है। पौधों की कोशिकाओं को विशेष पोषक माध्यम में सुसंस्कृत किया जा सकता है और पूरे पौधों को सुसंस्कृत कोशिकाओं से पुनर्जीवित किया जा सकता है। इन विट्रो में पौधे उगाने की इस तकनीक को "टिशू कल्चर" ("Tissue culture") कहा जाता है।

संक्रमित ऊतकों से प्राप्त कैली में सभी कोशिकाएं समान रूप से रोगजनक को नहीं ले जाती हैं। TMV-संक्रमित तंबाकू के कैलस से यंत्रवत् अलग की गई एकल कोशिकाओं में से केवल 40% में वायरस था। वायरस के संक्रमण से व्यवस्थित रूप से संक्रमित कैलस (systemically infected callus) की कुछ कोशिकाओं के भागने के दो संभावित कारण हैं -. a) वायरस पुनरावृत्ति सेल प्रसार के साथ तालमेल रखने में असमर्थ है, और b) कुछ कोशिकाएं उत्परिवर्तन के माध्यम से वायरस संक्रमण के लिए प्रतिरोध (resistance) प्राप्त करती हैं। पीछे वायरस के प्रतिरोधी कोशिकाएं अतिसंवेदनशील लोगों के साथ मूल ऊतक में भी मौजूद हो सकती हैं। सोमोक्लोनल भिन्नता का उपयोग करके कई रोग प्रतिरोधी पौधे (disease resistant plants) विकसित किए गए हैं। कैलस से पुनर्जीवित 370 टमाटर के पौधों में से छह ने TMV के प्रतिरोधी (resistant) दिखाया। इसी तरह, लेट ब्लाइट (late blilght - Phytophthora infestans) - प्रतिरोधी आलू के पौधे और चावल प्रतिरोधी कैली के बैक्टीरियल ब्लाइट (bacterial blight) विकसित हुए हैं।

रोगजनक द्वारा उत्पादित द्वितीयक चयापचयों का उपयोग रोग प्रतिरोधी पौधों को विकसित करने के लिए कैलस की जांच करने के लिए किया जा सकता है। विषाक्त पदार्थ कैलस को मार देंगे, लेकिन उत्परिवर्ती विष प्रतिरोधी कैलस जीवित रहेंगे। पुनर्जीवित विष प्रतिरोधी कैलस से रोग प्रतिरोधी पौधे प्राप्त हुए। ब्राउन स्पॉट रोगजनक (Brown spot pathogen - Helminthosporium oryzae) ने एक मेजबान विशिष्ट विष का उत्पादन किया जिसके लिए प्रतिरोधी पौधे सफलतापूर्वक विकसित किए गए हैं। इसी तरह, Helminthosporium maydlis - विष प्रतिरोधी मकई के पौधे, Phytophthora infestans - प्रतिरोधी तंबाकू के पौधे, H. sacchari प्रतिरोधी गन्ने के पौधे विकसित किए गए हैं। सोमाक्लोनल भिन्नता ऊतक संवर्धन व्युत्पन्न भिन्नता को संदर्भित करती है- ऊतक संवर्धन का उपयोग करके दैहिक कोशिकाओं से पुनर्जीवित पौधे, आनुवंशिक रूप से एक समान नहीं होते हैं, लेकिन महत्वपूर्ण आनुवंशिक परिवर्तनशीलता प्रदर्शित करते हैं। सहज उत्परिवर्तन की तुलना में यह परिवर्तनशीलता बहुत अधिक है। सोमासियोनल भिन्नता को बड़ी संख्या में पौधों की प्रजातियों (plant species - गेहूं / wheat, चावल / rice, जई / oats, मक्का / maize, तंबाकू / tobacco, आलू / potato, गन्ना / sugarcane, ब्रासिका / brassica, आदि / etc.) में फंगल, वायरल और जीवाणु रोगों (bacterial diseases) के प्रतिरोध जैसे विभिन्न लक्षणों के लिए प्रदर्शित किया गया है। प्रक्रिया में किसी भी चयनात्मक कारक के बिना पोषक माध्यम पर कई चक्रों (several cycles) के लिए सेल संस्कृतियों को बढ़ाना शामिल है, जिसके बाद पौधों का पुनर्जनन होता है।

रोग प्रतिरोधक क्षमता (disease resistance) के लिए पुनर्योजी और उनकी संतानों की जांच की जाती है। असंगत प्रजातियों के बीच संकर प्राप्त करने और रोग प्रतिरोधक क्षमता के लिए विदेशी जीनों के इंट्रोग्रेशन को प्राप्त करने के लिए भ्रूण बचाव और प्रोटोप्लास्ट संलयन तकनीक (protoplast fusion techniques) महत्वपूर्ण हैं। कई मामलों में, रोगों के प्रतिरोध (resistance to diseases) के लिए खेती किए गए जर्मप्लाज्म में उपयोगी आनुवंशिक परिवर्तनशीलता या तो सीमित है या कमी है। ऐसी स्थितियों में, जंगली जर्मप्लाज्म रोग प्रतिरोधक क्षमता के लिए उपयोगी जीनों का भंडार लगता है। विदेशी जीनों के समावेश में, कई पारगम्यता बाधाओं का सामना करना पड़ता है। कई मामलों में, संकर भ्रूण गर्भपात करता है। हालांकि, पोषक माध्यम पर सुसंस्कृत होने पर निकाले गए संकर भ्रूण को पौधों तक बढ़ाया जा सकता है। अलग-अलग स्रोतों से विदेशी जीनों को शामिल करने के लिए, भ्रूण बचाव आशाजनक लगता है।

विदेशी जीन को सम्मिलित करने और ट्रांसजेनिक पौधों का उत्पादन करने के लिए पुनः संयोजक डीएनए तकनीक के चालन में ऊतक संवर्धन तेजी से महत्वपूर्ण होता जा रहा है। वायरस कणों के सफल संक्रमण के लिए, कोट प्रोटीन (coat protein) को वायरल आरएनए से हटा दिया जाना चाहिए। यदि मेजबान को बड़ी मात्रा में कोट प्रोटीन (coat proteins) को संश्लेषित करने के लिए बनाया जाता है, तो नग्न वायरल आरएनए गठन नगण्य होगा। मेजबान कोट प्रोटीन (host coat protein) वायरस के आरएनए (RNA) को समाहित करेगा और इसके गुणन को रोक देगा। इसके परिणामस्वरूप लक्षण विकास में कमी और देरी होगी। उदा. तंबाकू मोज़ेक वायरस कोट प्रोटीन को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक तंबाकू के पौधे पौधों को इस वायरस से बचाते (protected) हैं।

ट्रांसजेनिक पौधों में वायरल जीनोम की अभिव्यक्ति ने वायरस संक्रमण को प्रतिरोध भी प्रदान किया। इन क्षेत्रों में वायरल पुनरावृत्ति के हिस्से के साथ-साथ कोट प्रोटीन के एंटीसेंस आरएनए शामिल हैं। ककड़ी मोज़ेक वायरस के उपग्रह आरएनए की डीएनए प्रति के साथ परिवर्तित ट्रांसजेनिक तंबाकू के पौधों को सीएमवी (CMV) के साथ टीकाकरण के बाद बड़ी मात्रा में उपग्रह आरएनए का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया था और लक्षण विकास काफी कम हो गया था।

इन विट्रो में कवक के विकास (growth of fungi) को रोकने की क्षमता वाले प्रोटीन (Proteins) पौधों में प्रचुर मात्रा में मौजूद होते हैं। ट्रांसजेनिक पौधों में इन जीनों की संवैधानिक अभिव्यक्ति इन पौधों को कवक प्रतिरोधी बना सकती है। बीन काइटिनेज को संवैधानिक रूप से व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक तंबाकू के पौधों को Rhizoctonia solani के लिए बढ़ा हुआ प्रतिरोध प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है। हाल ही में, जौ से राइबोसोम निष्क्रिय प्रोटीन व्यक्त करने वाले तंबाकू के पौधों ने R. solani के लिए प्रतिरोध दिखाया। RiPs स्वयं राइबोसोम को निष्क्रिय नहीं करते हैं और कवक सहित दूर से संबंधित प्रजातियों के राइबोसोम के प्रति गतिविधि दिखाते हैं।

ट्रांसजेनिक तंबाकू के पौधों में मूंगफली स्टिलबिन सिंथेस जीन की संवैधानिक अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप रेस्वेराट्रोल (resveratrol - फाइटोएलेक्सिन / phytoalexin) का संश्लेषण होता है और ट्रांसजेनिक पौधे Botrytis cinerea के प्रति प्रतिरोध दिखाते हैं।

एसीटाइलट्रांसफेरेज़ को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक तंबाकू के पौधे जो टैबटॉक्सिन को डिटॉक्सीफाई करते हैं, Pseudomonas syringae pv. tabaci के लिए प्रतिरोध दिखाते हैं। हाल ही में, Manduca sexta, तंबाकू हॉर्न वर्म से काइटिनेज जीन को R.solani के खिलाफ अपनी विरोधी क्षमता बढ़ाने के लिए P.fluorescens में क्लोन किया गया है।

मेरिस्टेम या शूट टिप संस्कृति

मेरिस्टेम और शूट टिप संस्कृति का उपयोग संक्रमित जर्मप्लाज्म से वायरस को खत्म करने के लिए किया जाता है। यह लंबे समय से देखा गया है कि पौधों के तेजी से बढ़ते मेरिस्टेम आमतौर पर वायरस से मुक्त होते हैं, या कम से कम गैर-मेरिस्टेम कोशिकाओं की तुलना में वायरस की सांद्रता बहुत कम होती है। इस स्थिति का उपयोग मेरिस्टेम संस्कृति द्वारा वायरस मुक्त पौधों के उत्पादन के लिए किया गया है। इसका उपयोग मुख्य रूप से कसावा, आलू, शकरकंद और सजावटी पौधों में किया जाता है।

"वायरस-मुक्त" ("Virus-free") शब्द का उपयोग साहित्य में शिथिल रूप से किया गया है। एक से अधिक प्रकार के वायरस से संक्रमित पौधे और कुछ अज्ञात वायरस भी ले जा सकते हैं। इस प्रकार, एक पौधे को केवल उन वायरस से मुक्त होने का दावा किया जा सकता है जिनके लिए विशिष्ट परीक्षणों ने सकारात्मक परिणाम (gative result - संभवतः नकारात्मक / negative result) दिया है, हालांकि, शब्द "वायरस-मुक्त" ("virus-free") अभी भी बागवानों द्वारा इसके व्यावसायिक मूल्य के लिए बरकरार रखा गया है।

रोगजनक हमले से हमेशा पौधे की मृत्यु नहीं होती है। कई वायरस दृश्य लक्षण भी नहीं दिखा सकते हैं। हालांकि, पौधों में वायरस की उपस्थिति फसलों की उपज और गुणवत्ता को कम कर सकती है। यह सर्वविदित है कि पौधों में वायरस का वितरण असमान है। संक्रमित पौधों में, एपिकल मेरिस्टेम आमतौर पर या तो मुक्त होते हैं या वायरस की बहुत कम सांद्रता ले जाते हैं। पुराने ऊतकों में, मेरिस्टेम युक्तियों से बढ़ती दूरी के साथ वायरस का टिटर बढ़ता है।

वायरस के लिए मेरिस्टेम के 'प्रतिरोध' को अंतर्निहित तंत्र की व्याख्या करने के लिए पांच मुख्य संभावनाएं सुझाई गई हैं।
(i) उपयुक्त संवहनी या प्लास्मोडेस्मेटल कनेक्शन की कमी से मेरिस्टेम से वायरस का बहिष्कार।
(ii) तेजी से विभाजित मेरिस्टेम कोशिकाओं द्वारा प्रमुख चयापचयों के लिए प्रतिस्पर्धा।
(iii) मेरिस्टेम कोशिकाओं में पदार्थों का उत्पादन जिससे वायरस का टूटना होता है।
(iv) वायरस पुनरावृत्ति की मशीनरी के कुछ प्रमुख घटकों में कमी, और
(v) वायरस पुनरावृत्ति के अवरोधकों की उपस्थिति।

वायरस उन्मूलन को प्रभावित करने वाले कारक

संस्कृति माध्यम, एक्सप्लांट आकार और संस्कृति भंडारण जैसे कारक वायरस उन्मूलन को प्रभावित करते हैं। इसके अलावा, संस्कृति से पहले या उसके दौरान ऊष्मा उपचार इस तकनीक की दक्षता को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करता है। एक्सप्लांट्स का शारीरिक चरण मेरिस्टेम टिप कल्चर द्वारा वायरस उन्मूलन को भी प्रभावित करता है।
(i) पूर्ण पौधे प्राप्त करने में सफलता को संस्कृति माध्यम की पसंद से काफी हद तक सुधारा जा सकता है। संस्कृति माध्यम की प्रमुख विशेषताओं पर विचार किया जाना इसके पोषक तत्व, वृद्धि नियामक और शारीरिक परिपक्व हैं।
(ii) मेरिस्टेम टिप का आकार मेरिस्टेम की पुनर्जनन क्षमता को नियंत्रित करने और वायरस मुक्त पौधे प्राप्त करने वाला एक महत्वपूर्ण कारक है। उदाहरण के लिए, कसावा में, 0.2 मिमी (mm) आकार से अधिक मेरिस्टेम प्लांटलेट्स में पुनर्जीवित हो जाते हैं, लेकिन जो 0.2 मिमी (mm) से कम आकार के होते हैं वे जड़ों के साथ गैलस या कैलस विकसित करते हैं। सामान्य तौर पर, मेरिस्टेम जितना बड़ा होगा, पुनर्जीवित पौधों की संख्या उतनी ही अधिक होगी, लेकिन वायरस मुक्त पौधे की संख्या सुसंस्कृत मेरिस्टेम के आकार के व्युत्क्रमानुपाती होती है।
(iii) मेरिस्टेम - टिप संस्कृतियों के लिए प्रकाश ऊष्मायन आमतौर पर अंधेरे ऊष्मायन से बेहतर साबित हुआ है। आलू की टिप संस्कृतियों को शुरू करने के लिए इष्टतम प्रकाश तीव्रता 100 लक्स है, जिसे 4 सप्ताह के बाद 200 लक्स तक बढ़ाया जाना चाहिए। संस्कृतियों को आम तौर पर समझ मानक संस्कृति कक्ष तापमान (understandard culture room temperatures - 25 ± 2ºC) में संग्रहीत किया जाता है।
(iv) मेरिस्टेम टिप्स अधिमानतः सक्रिय रूप से बढ़ती कलियों से लिया जाना चाहिए। टर्मिनल कलियों से ली गई युक्तियों ने एक्सिलरी कलियों की तुलना में बेहतर परिणाम दिए।

कसावा मोज़ेक वायरस को खत्म करने के लिए मेरिस्टेम टिप संस्कृति

तेजी से बढ़ने वाली वानस्पतिक कलियों को निकाल दिया जाता है, बाँझ आसुत जल से धो दिया जाता है और फिर 2-3 मिनट के लिए मर्क्यूरिक क्लोराइड के घोल (mercuric chloride solution - 0.1%) में डुबोकर कीटाणुरहित किया जाता है। फिर कलियों को बाँझ आसुत जल के कई परिवर्तनों से धोया जाता है। माइक्रोस्कोप के तहत, 3-4 लीफ प्राइमोर्डिया (leaf primordia - 0.3 से 0.6 मिमी आकार में / 0.3 to 0.6 mm in size) को एक बाँझ स्केलपेल के साथ कली से हटा दिया जाता है। इसके बाद कलियों को परीक्षण ट्यूबों में मुराशीगे और स्कूग माध्यम में सड़न रोकनेवाला स्थानांतरित कर दिया जाता है और 45 दिनों के लिए प्रकाश में 25 ± 2'C पर ऊष्मायन किया जाता है। फिर प्लांटलेट्स को टेस्ट ट्यूब से हटा दिया जाता है, टैब पानी में धोया जाता है और सख्त करने के लिए 3-4 दिनों के लिए हाइलैंड समाधान में रखा जाता है। प्लांटलेट्स को 3:1 के अनुपात में पीट मिट्टी और वर्मीक्यूलाइट वाले गमलों में स्थानांतरित किया जाता है और 5-7 दिनों के लिए मिस्ट चैंबर में रखा जाता है। पौधों को आगे के अध्ययन के लिए ग्लास हाउस में स्थानांतरित किया जाता है।